Патент ссср 379102

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимый от па

Заявлено 05.Ч11.1

Приоритет 06.Ч11 ландия

Комитет пе делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

О публ и ковано 18.

Дата опубликова

Автор изобретения

Иностранец

Теренс Мартин Скерман (Великобритания) Иностранная фирма

«Нью Зиленд Инвентпнз Девелопмент Осорити» (Новая Зеландия) Заявитель

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

М И КРООРГАН ИЗМОВ

Известно использование питательной среды содержащей энзиматический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, тиогликолевую кислоту для культивирования бактерий (аэробных и анаэробных). Однако культивирование микроорганизмов Бактероидес Нодозус Бевериджа на известных питательных средах не обеспечивает получение клеток необходимой концентрации с высокой активностью.

Сущность изобретения заключается в том, что в состав питательной среды введен органический восстановитель двуокись углерода и

1-аргинин или его соли. Водный питательный бульон содержит: энзиматический перевар (гидролизат) казеина, мясной экстракт или перевар (гидролизат), органический восстановитель, дрожжевой экстракт, аминокислоты, L-аргинин, углекислый натрий (соду), растворимый крахмал и двуокись углерода. рН среды около 7,8 в анаэробных условиях в присутствии двуокиси углерода.

Энзиматический перевар казеина обеспечивает источник пептидного азота, имеющий существенное значение для роста (размножения) Б. Нодозус. Могут быть использованы и другие энзиматические перевары казеина, но из всех проверенных триптиказа обеспечивает наибольший рост.

Гидрохлорид цистеина (0,04 об. % ), формальдегидсульфоксилат натрия (0,03 об. %) или аскорбиновая кислота (0,25 об. %) являются столь же эффективными восстановителями, как тиогликолят натрия или тиогликолевая кислота. Последние два восстановителя

5 имеют то преимущество, что их можно автоклавировать вместе со средой.

1-аргинин в виде свободного основания или в виде соли моногпдрохлорида являются сущестгенпыми специфическим питательным ве10 ществом для Б. Нодозус. Он найден почти в любом питательном бульоне, но в пропорции значительно ниже оптимальной. Опыты показали, что добавка 1-аргинина в специфических количествах (пропорциях) в питательную

15 культуральную жидкость, в которой он содержится не в оптимальном количестве, повышает рост бактерий в !Π— 100 раз. Углекислый газ, составляющий газовую фазу внутри культурального аппарата. также является сущест20 вепным питательным веществом. Сода добавляется в среду для буферирования кислотности, вызванной растворенным углекислым газом. Серии значительно стимулирует рост

Б. Нодозус. Некоторые штаммы Б. Нодозус

25 стимулиру!Отся TBK?Ke лизином. Он включен в питательную среду для общего применения.

Рост Б. Нодозус в питательной среде, повидимому, не увеличивается при дополнительной подаче (введении) углеводов. Однако ко30 нечный выход увеличивается при введении в

3-91 0 7

65 питательную среду небольшого количества растворимого крахмала. Добавка крахмала облегчает также извлечение бактериальных клеток из культуры при центрифуговании.

Предлагаемая питательная среда может быть использована для непрерывного способа выращивания, в основном, как это требуется для анаэробных бактерий, нуждающихся в углекислом газе.

Культивирование Б. Нодозус осуществляют в обычной культуральной среде при добавлении соответствующего количества 1-аргинина, значительно повышающего рост микроорга низ мов.

Вакцины получают из бактериальных клеток или растворимых продуктов культур одного из более штаммов Б. Нодозус после обработки формалином или другим бактерицидным средством и добавления соответствующего адъюванта.

Жидкую среду приготовляют следующим образом.

Один литр среды содержит, г: энзиматического гидролизата казеина 1 — 50, предпочтительно 15; мясного экстракта или перевара

1 — 50, предпочтительно 5; органического восстановителя 0,1 — 5, предпочтительно 1; дрожжевого экстракта 0,1 — 10, предпочтительно 2; аминокислоты 01 -серии 0,1 — 5, предпочтительно 1,5; гидрохлорид L-лизина 0,1 — 5, предпочтительно 1; 1 -аргинина 1 — 50, предпочтительно 5; растворимого крахмала 0,1 — 20, предпочтительно 0,5.

Крахмал растворяют отдельно в 200 мл кипящей дистиллированной воды, фильтруют через ватманскую бумагу Ко 3, и фильтрат вливают в среду (содержащую остальные компоненты). рН среды доводят 4М. едким натром до 7,6 — 7,8, конечный объем доводят дистиллированной водой до 1 л.

Подходящими аппаратами служат стеклянные бутыли (флаконы) с винтовыми колпачками (завинчивающимися), перфорированными металлическими, с каучуковой или неопреновой вставкой. Флаконы или бутыли заполняют примерно на половину средой, колпачки слабо завинчивают и автоклавируют при

121 С в течение 15 мин. После падения давления (в автоклаве) до атмосферного, флаконы — еще горячие — извлекают, и тут же туго завинчивают колпачки. Создающийся при этом частичный вакуум доводят до атмосферного давления добавлением 100 О/о -ного стерильного без примеси кислорода углекислого газа, который инъецируют через колпачек.

Профильтрованный через фильтр Зейца

20 об. раствор соды вводят аналогичным образом до конечной его концентрации в среде 0,2об %

Среда (для серийного периодического выращивания) готова к инокуляции.

Для выращивания культур в аппаратах непрерывного действия готовят большие количества жидкой питательной среды и стерилизуют в склянках (бутылях) аналогичным об5

4 разом, Склянки со средой cwcTBBëÿþò охлаждаться под током стерильного углекислого газа.

Обезкислороженный углекислый газ также подают в среду в ферментер либо в виде

100 /о-ного углекислого газа, либо в смеси с азотом, в зависимости от скорости выращивания микроорганизмов, которую необходимо поддерживать в аппарате.

Инокулят готовят следующим образом.

В ампулу, содержащую высушенные замораживанием (лиофиллизированные) живые клетки аутеничного штамма или штамма

Б. Нодозус, вносят 0,05 мл стерильного питательного бульона. Образующуюся клеточную суспензию инокулируют на пластинках агаровой среды, содержащей, кроме перечисленных компонентов, 15 г/л агар †ага.

С пластинок сливают стерильную расплавленную среду и сушат при 37 С не дольше

5 мин. После засева штриховкой их помещают немедленно в анаэробные колбы (например, колбы для анаэробных культур, снабженные катализатором) при комнатной температуре, в которых затем создают вакуум и трижды наполняют смесью из 90 водорода и 10О/о углекислого газа. Культуры инкубируют 3 — 4 дня при 37 С.

Пробирки, содержащие 10 мл стерильной жидкой среды, приготовленной описанным способом, но без добавки свежеприготовленной соды или хранившейся в атмосфере водорода, инокулируют петлей роста бактерий с

2 — 3-дневной агаровой культурой бактерий.

Пробирки инкубируют в течение 24 — 72 час при 37 С в анаэробных колбах в атмосфере из

90 /о водорода и 10О/о углекислого газа. Образующийся рост в логорифмической фазе используют для засева бутылей (флаконов) больших серий культур при помощи асептических инъекций шприцем через колпачки.

Рост в аппаратах с непрерывной культурой начинают таким же образом. Все культуры инкубируют при 37 С.

3,0 мл 24 — 48-час посевной культуры, содержащей около 10 бактериальных клеток, инокулируют описанным способом в 300 мл — партию жидкой среды, так что в течение 18—

48 час получается 3 — 6 108 клеток/мл или больше, в зависимости от взятого штамма.

Получение вакцин.

Полученные культуры пригодны для приготовления вакцины следующим образом.

А. Клеточная в акции а. Бактериальные клетки в культуре убивают добавлением соответствующего бактерицидного средства, например 0,01 об. о/о формалина. Культуральную жидкость отфуговывают для выделения клеток, которые суспендируют в фосфатном буферном растворе (рН 6,8), содержащем

0,5 /о формалина, или другого подходящего консерванта, до конечной концентрации

3 10 — 3 10 клеток/мл, предпочтительно

3 10 — 3 10-" клеток/мл. Затем клеточную

10

55 б0

65 вуспензию смешивают с подходящим адъювантом, например с неполным адъювантом

Фрейнда, смешиванием 35 ч. клеточной суспензии с 1 ч. липофильного эмульгатора, например полиоксиэтилен-моноолеат сорбитана, и эмульгировапием образующейся водной фазы с 9 ч. масляной фазы, например Арлацел А.

Получают клеточную вакцину.

Б. Супернатантная вакцина. Надосадочную жидкость с отфугованной культуры обрабатывают с целью получения концентрата экстрацеллюлярного антигенного материала путем, например, диализа, ультрафильтрации или соосаждения. Образующийся концентрат доводят при помощи подходящего адъюванта, например неполного адъюванта

Фрейнда, до 2 — 100-кратной концентрации первоначального объема супернатантной культуральной жидкости. Получается супернатантная вакцина.

В. Объединенная клеточная и суп е р н а т а н т н а я в а к ц и н а. Водную клеточную вакцину А, формализованную (обработанную формалином) клеточную суспензию, приливают к концентрированной.супернатантной жидкости, приготовленной, как супернатантная вакцина Б, затем добавляют соответствующий адъювант, например, неполный адъювант Фрейнда, до конечной (плотности) концентрации 10 †11 " клеток/мл, предпочтительно 10 — 10" клеток/мл, плюс 2 — 100-кратный концентрат супернатантной жидкости. ПОлучают комбинированную клеточную плюс супернатантную вакцину.

Эффективную дозу одной из полученных вакцин, предпочтительно 1,0 мл, вводят овце внутримышечно или подкож <о. Дозу можно повторить через 2 недели или в любое время после начальной либо сенсибилизирующей дозы. Результаты показали, что обработанные таким образом овцы проявляют значительную степень иммунитета в ответ на инфекцию изъязвления кожи конечной по сравнению с невакцинированными контрольными животными. Кроме того, вакцина, введенная овце, уже проявляющей клинические признаки (симптомы) этого заболевания, оказывает значительное терапевтическое действие.

Пример 1. Одиннадцать овец инокулируют внутримышечно в крестец (огузок) адъювантной клеточной вакциной, приготовленной описанным способом. Каждому животному вводят 1 лл вакцины, содержащий 1 10" бактерий (группа I).

Для сравнения другие 10 овец инОкулируют адъювантной супернатантной вакциной, Каждому животному вводят по 1 мл вакцины, содержащий концентрированную супернатантную жидкость, полученную от 100 мл культуры (группа II).

Для дальнейшего сравнения 9 овец инокулируют адъювантной комбинированной клеточной плюс супернатантной вакциной. Каждому животному вводят 1 мл вакцины, содержащий 1 10" бактерий, плюс концентрпрованпую супернатантную жидкость, полученную от 100 мл культуры (группа III), Для дальней шего сравнения 10 овец не инокулируют никакой вакциной (группа IV).

Через пять недель после 9 из 10 невакцинированных овец (группа IV) проявляют йризпаки заболевания по сравнению с 2 из 11 (группа I), 1 из 10 (группа II) и 2 из 9 (группа III). Это доказывает значительно меньшее количество заболеваний в любой из вакцинированных групп по сравнению с невакцинированной группой.

Пример 2. Семьдесят овец инокулируют подкожно в области шеи адъювантной клеточной вакциной. Каждому животному вводят

1 мл вакцины, содержащий 1 ° 10 о бактерий.

Через 14 дней каждому животному вновь вводят 1 мл вакцины, содержащий 1 ° 10" бактерий. Для сравнения другую партию из

70 овец инокулируют адъювантной клеточной вакциной. Каждому животному вводят 1 мл вакцины, содержащий 1 ° 10" бактерий, один только раз, притом в тот же день, когда производят первую вакцинацию дважды вакцинированной группе. Для дальнейшего сравнения группу еще из 70 овец не подвергают никакой вакцинации.

После этого все 210 овец сгоняют в один загон и подвергают натуральному заражению, присоединяя к стаду 12 зараженных овец через 4 недели после первой инъекции.

Инфекция изъязвления кожи конечностей овец не получила широкого распространения в течение нескольких недель после совместного нахождения овец. Однако через 10 недель после заражения 43 из 70 невакцинированных овец заболели, в то же время заболели 12 из

70 однократно вакцинированных при 5 из 70 дважды вакцинированных. Таким образом, отмечено значительное предохранение от инфекции в обеих вакцинированных группах.

Пример 3. Тридцать семь овец, больных изъязвлением кожи конечностей, инокулируют подкожно в области шеи адъювантной клеточной вакциной. Каждому животному вводят

2 мл вакцины, содержащие 1 10" бактерий.

Через 7 дней животным вновь вводят по 2 мл вакцины, содержащих 1.10" бактерий.

Для сравнения другим 20 овцам, страдающим этим заболеванием, вводят адъювантный препарат, не содержащий бактерий, в тот же день, когда производят первую вакцинацию дважды вакцинированной группе.

Через 6 недель после первой инъекции ЗЗ из

37 овец дважды вакцинированных вакциной, содержащей бактерии, перестают болеть (выздоравливают), в то время как из 20 овец, инъецированных препаратом, не содержащим бактерий, выздоравливают лишь 3.

Таким образом, содержащая бактерии вакцина вылечивает значительно большее количество животных, чем препарат, не содержащий бактерий.

379192

Предмет изобретения

Составитель P. Махнюк

Техред Т. Миронова

Редактор Д. Пинчук

Корректор Л. Бадылама

Заказ 1921/14 Изд. № 483 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/б

Типография, пр. Сапунова, 2

Питательная среда для культивирования микроорганизмов, включающая энзиматический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, мясной экстракт или перевар, отличающаяся тем, что, с целью увеличения концентрации клеток с высокой активностью при культивировании микроорганизмов Bactегоides Nadosus, в ее состав введен органический восстановитель, двуокись углерода и 1 -аргинин или его соли.