Вптб

 

00003

ОП ИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К hkffHTV

Союз Советских

Социалистицеских

Республик

404I95

Зависимый от патента №вЂ”

М. Кл. А 61k 19/00

С 07g 7/028

Заявлено 13.11.1969 (№ 1309423/31-16) Приоритет 15,11,1968, № 7544/68 и ОЗ.XII.1968, № 57373/68, Великобритания

Гасударственный номитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 26.Х.1973. Бюллетень № 43

Дата опубликования описания 5.IV.1974

УДК 615.779.94 (088.8) Авторы изобретения

Иностранцы

Пер Стаффан Делин, Бертил Аке Екштрем, Берндт Олоф Харальд

Сьеберг, Карл Хьюго Телин и Ларс Селве Натхорст-Вестфелт (Швеция) Иностранная фирма ВПТУ

«Актиеболагет Астра» (Швеция) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПОАЛЛЕРГEHHOIO ПЕНИЦИЛЛИНА

" ) фунт}д}от} = 0,070307 кгс, гл -.

Изооретвн}ие относится к области медици ны, точнее к производству антибиотиков.

Известен способ получения гипоаллергенного пенициллина, заключающийся в том, что бензилпен}ициллин,подвергают гидролизу фер- б ментом, выделенным из Е. Coli, образовавшуюся 6-аминопвнициллановую кислоту освобождают от белков-аллвргвнов путем диализа или гелыфильтрац}ии,и превращают в целевой продукт, известным лутем.

Цель изобретения — упрощение процесса.

Это достигается тем, что гидролиз осуществляют гипоаллергенны}м ферментом, выделенным из клеток, разрушенных продавливааоием через мембрану шириной 0,1 — 1,5 лл в 1б течение 0,05 — 1,,0 сек под давлением 34-136 атл.

П р им е р 1. По.чучение клеток бактериальной культуры. ,Питательную среду,,имеющую следующий > соста|в: кукурузный экстракт 3 кг, соевое масло 135 лл, пара фин — парафин 12 лл, цета нол 3 лл, вода 150 л, рН вЂ” 6;О, стерилизуют при 124 С в течение 30 лин, засевают 100 лл

20 — 24 час культуры E. Coli (Ast}.a 1339) и инкубируют при 25 С с продуванием и .перемешиванием в течение 18 час.

Затем почученной культуральной жидкостью засевают ферментер с посевной средой, имеющей следующий состав: кукурузный эк- 30 стракт 300 кг, соевое масло 13,8 кг, парафин

1,22 кг, цвтанол 0,3 кг, фенилуксуоная кислота 2,1 кг, хлористый натрий 112 кг, вода

14000 л, рН 6,6.

Через 24 час после инкубации при 25 С с перемеш}иванивм:и,продуванием воздуха, когда рН увеличиваегся до 8,2, бактериальные клетки убивают .путем добавления бутилацетата (180 л) и смесь после этого охлаждают.

П р:и м е р 2. Выделение iH очистка ацплазы.

Отделение питательной среды и продавая ванне клеточного вещества проводят одновременно в самоочищающемся центробежном сепараторе, работающем прои 0 — 50 С, в котором отделенное клеточное вещество продавливается в пульсирую цем цикле за время

0,05 — 1,0 сек через мембрану со щелью шириной 0,1 — 1,5 лл под давлением 500 — 2000 фунт/дю}i м .")

Пасту бактериальных клеток собирают B .порции по 100 кг, к каждой из которых прибавляют 3,0% метилизобутилкетон,,и смесь гомогенизируют с помощью мешалки в течение 25 лин. Оощий выход бактериальной мас,сы 325 кг.

Полученную пасту бактериальных клеток используют в экспериментах по изучению со404195

G5 любилизации эцзима (к 100 г,клеточной пасты добавляют 100 мл деионизированной воды). .Полученную суспензию обрабатывают, нал ример, следующим образом.

Суспенз ию гомогенизируют с помощью мешалки в течение 5 мин, образец охлаждают в бане со льдом, чтобы температура образца не поднималась выше 35 С. Затем о|бразец центрифугируют при 5000 G (центробежная сила, выраженная через ускорение силы тяжести) в течение 20 мин и определяют активно сть энзима в поверхностном слое.

Гомогенизированную бактер иальную пасту (175 кг, а кти вность 190 ед/г) разбавляют водой (175 кг) и при перемешивании смеси додо|бавляют Нуйо (22,7 кг), Celite 505 (22,7 кг), Fibcaflo (10,2 кг). Водную фазу отделяют путем фильтрования через фильтр Funda u остаток на фильтре,промывают водой (50 л).

Соединенные растворы (290 кг),имеют акт ивность 48 ед/г. .Гомогенизированную бактериальную пасту (1 кг, активность 212 ед/г),разбавляют водой (2,0 л), устанавливают рН 8,5 путем добавле. ния 0,5 N раствор NaOH (220 мл) и затем перемешивают при 20 С в течение 30 мин. Смесь центрифугируют при 13200 G в течение 30 мин при 0 С. Далее декантируют поверхностный слой жидкости, осветляют его фильтрованием н получают 2,7 кг раствора с активностью

50 ед/г. Повторное суспензирование осадка от центри фугирования в воде (I л) дважды в течение 5 мин .при рН 8,5.с,последующим центрифугированием, давало дополнительное количество раствора энзима (2 кг, активность

11 ед/г). Это соответствует общему выходу водораствор имой ацилазы, равному 74%.

Из полученного прозрачного раствора ацилазы (2 кг, активность 50 ед/г) методом лиофильной сушки получают 98,5 г твердой ацплазы с активностью 950 ед/г.

Гомогенизированную бактериальную пасту (1 кг, активность 128 ед/г) центрифугируют ири 13200 6 в течение 30 мин при 0 С. Затем декантируют поверхностный слой жидкости

1500 г, активность 80 ед/г), осветляют фильтрован ием и,используют для энзиматическог0 расщепления пенициллина с получением 6аминопенициллинсвой кислоты.

П р и м е.р 3, Получение 6-аминопенлциллиновой кислоты.

К раствору энзима (283 г, активность 42 ед/г) .прибавляют раствор .калиевой соли бензилпенициллина (20 г) в воде (317 мл), Смесь выдерживают в термостате при

37 С, рН .поддерживают на уровне 7,8,,перно дически дооавляя 2,5 N раствор NaOH. Черсз

6 час реакционную смесь, содержащую 10,7 г

6-аминоченициллнцовой кислоты (92% ), ср I;IbTpуют.

Раствор подкисляют до рН 3 5М,соляной кислотой и экстрагируют,половинным объемом метилизооутилкетона для удаления остатков бензилпенициллина и фе

25 зо

60 кислоты, которая входит в молекулу в виде бокового ответвления и отщепляется в процессе образования 6-аминопенициллиновой кислоты. После зкстраги рования водный раствор отделяют от метилизобутилкетана, рН водного раствора устанавливают равным 7,5, упаривают в вакууме до объема 120 мл, охлаждают до 5 C и фильтруют. При подкислении фильтрованого раствора 5N соляной кислотой до рН 4,3 осаждают кристаллическую 6-аминопенициллиновую,кислоту. После отфильтровывания кристаллы промывают слегка охлажденной водой, затем ацетоном и высушивают в вахуу ме с,получением 8,84 г 6-аминопенициллияовой к ислоты.

П р,и. м е.р 4. Получение паранитробензилового эфира 6-аминоленициллиновой кислоты.

Раствор энзима (18,6 г, активность 1610 ед/г) разбавляют водой (700 мл),и .метанолом (120 мл), устанавливают рН 7,8, добавляя

0,1 N раствор NaOH è прибавляют раствор и нитробензил бензилпеиициллината (3,1 г, 6,6 моль) в метаноле (60 мл).

Смесь перемешивают при 37 С и поддерживают рН 7,8, добавляя 0,1 N ра спвор NaOH.

Через 2,5 час смесь охлаждают и экстрагируют этилацетатом (500 мл). Кислый слой отделяют и экстрагируют дополнительной порцией этилацетата (250 мл), орга ничес кие слои соединяют вместе и высушивают оезводным сульфатс1м натрия .в течение 1 час. После фильтрования органический раствор разделяют на 2 равные части. Одну часть упаривают в ва;кууме при комнатной температуре ,и получают свободный и-нитробензиловый эфир 6-аминопенициллиновой кислоты в виде маслоподобного осадка. К другой части раствора в этила цетате прибавляют бензолсульфоновую кислоту (0,58 г), растворенную в ацетоне (20 мл) и упаривают,полученную

".ìåñü в вакууме,до объема 30 мл.

После добавления серного эфира (10 мл1 и выдерживация смеси в течение почи на льду осаждается бепзолсульфоново-кислая соль и-нитробензил — 6-амииопепициллината (0,8 г) в виде белыьх кристаллов с т. пл. 148 — 151 С.

П р,и м е р 5. Энзиматический синтез бензилпениц иллина.

6-амипопенпцпллиповую кислоту (175 мг) и фенилуксусную кислоту (111 мг) растворяют в буферном растворе фосфата калия (!0 .«л при рН 7,0) и к полученному раствору добавляют растворенную в воде ацилазу.

Устанавливaþò рН Ira уровне 5,0 с помощью

1 М раствора Н РО4 и выдерживают в термостате .при 37 С. Через 4 час раствор охлаждают и анализируют методом бумажной хро матографии. 30% 6-аминопенициллиновой кислоты превращаются в бепзилпенициллин.

П р е д м е т и з о б р е т е.н.и я

Способ,получе1гия гипоаллергенного пеяицнлли ra путе м ферментативного гидролиза беп3илпеницилл:пIà ферментом и3 клеток

404195

Сост";!;i;òtã: С. Щснсва

Техрсд Е. Борисо.ia

Редактор Д, Пинчук

Корректор О. Тюрина

Заказ 214 Изд. № 201 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, )K-35, Раугпскак l0., д. 4, 5

Тип. Хар,к ф::.з п1 - «1Татсi т >

E. Co1i до 6-аминопсни циллановой кислоты с последующим ее превращением в целевой продукт известным путем, отличающийся тем, что, с целью упрощения .процесса, гидролиз осуществляют гипоаллергенным ферментом, выделенным из клеток,,разрушенных продавливанием через мембрану со щелью шириной

0,1 — 1,5,ил в течение 0,05 — 1,0 сек под давлением 34 — 136 атм.