Патент ссср 417940

 

Енто О. 1,., „

I : ескал

1 вот -,;„.—; A

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

4!7940

Союз Советских

Социалистических

Реслублик

Зависимый от патента K

М, Кл. С 07с 103/52

Заявлено 31 VI!!.1969 (Ф 1368679/23-4) Приоритет 30.08.68 (31) 13067/68

Швейцария

Опубликовано 28.02.74, Бюллетень _#_9 8

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР оа делам иэааретеннй и открытий

3 . 1К 547.964Л.07(088.8) Дата опубликования описания 06.08.74

Авторы изобретения

Иностранцы

Вернер Риттел, Макс Бруггер, Бруно Камбер, Бернхард Риникер, Петер Зибер (Швейцария) и Гендрик Мари Гревен (Нидерланды) Иностранная фирма

«Циба-Гейги АГ» (Швейцария) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПОКАЛЪЦЕМИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

1 вЂ С S 1 е в 9 5 G т в 9 10

3.— СН вЂ” СΠ— тли- аси-лей- сев-тve-цис-мет-лей-тли11 11 13 1 19 1в 1т 18 19 20 "i — тле — тив-тле — тлн- асп- фад- асн-л119- фал — тис — тве« Е

Изобретение относится к области получения новых пептидов, которые могут найти применение в качестве эффективных средств при гиперкальцемиях и заболеваниях костей. где R — Н, ИН или ацил — NH, или соответствующих соединений, в которых остатки аспарагина или глутамина могут быть заменены остатками аспарагиновой или глутаминовой кислот, или остаток аспарагиновой кислоты может быть заменен остатком аспарагина, заключающийся в том, что пептид из не менее семи первых аминокислотных остатков, содержащий дисульфидный мостик, конденсируют обычным методом с применением защитных

Получаемые согласно предлагаемому способу пептиды являются родственными либо идентичными тиреокальцитонину человека.

Предлагаемый способ получения гипокальцемических пептидов общей формулы групп для всех илп части NHq, ОН и СООНгрупп, с пептидом с последующим удалением защитных групп. Остатки аспарагиновой и глутаминовои кислот могут быть заменены ас10 парагином и глутамином соответственно.

Пример 1. БОК-цис(три)-гли-асн-лейN HNH .

710 мг Н-гли-асн-лей-Π— Ме и 1,36 г БОКцис(три)-ОН растворяют в 12 мл ацетонит15 рила и к охлажденному до 0 С раствору при41794О бавляют 820 мг дициклогексилкарбодиимида.

После 30 мин при 0 С и 60 час при 28 С отсасывают дициклогексилмочевину и фильтрат упаривают. K остатку прибавля;от петро letlный эфир, растирают, петролейный эфир cJliIвают и остаток растворяют в этилацст=те.

Раствор промывают при 0 С разбавленным раствором лимонной кислоты, водой, раствором бикарбоната натрия и водой, сушат сульфатом натрия и упаривают. Получшшое в виде бесцветной смолы тетрапептидпроизводн д.,я о истки неоднократно ос, ждают из ацетона эфиром. Получают порошок с выходом

1,2 г, который однороден при хроматографии в тонком слое силикагсля; R; 0,39 в системс хлоро(рорм — метанол (9: 1) .

988 мг БОК-цис(три) -тли-асн-лей-Π— Ме растворяют в 20 мл метанола и к охлажденному до 0 С раствору прибавляют 2 M;I гидразингидрата. После 14 час при 2 С прибавляют

200 мл холодной 0,5 н, уксусной кислоты, осадок основательно растирают, отсасывают, промывают до нейтральной реакции ледяной водои и сушат в течение ночи в вакуум-эксикаторе. Сырой БОК-цис (три) -гли-асн-лейг»,÷ðà3èä очищают двукратным переосаж ением из метанола водой. При хроматографии в тонком слое на силикагеле Rr 0,2 в системе хлороформ — метанол (9: 1) .

П р и мер 2. Н-сер(тбу)-тре(тбу)-цис(три)мет-лей-гли-ОН-ХСНЗСООН.

К 857 г ДПК-сер(тбу)-тре(тбу)-МНХН2 в

8,0 мл диметилформамида приоавляют при — 10 С 1,87 мл 2,0 и. -1С1 в этилаце ате и

0,19 мл трет-бутилнитрита.,После 15 мин прибавляют по каплям и;;и пропускании азота раствор 665 мг 1-1-цис(три)-мет-лей-гли-01-1 в

0,665 мл триэтиламипа в 7 мл диметилфорAIамида. Перемешивают в течение 1 час при — 10 С и оставляют стоя |ь в течение 24 час при 0 С. Упаривание реакционной смеси -,о

3 мл (глубокий вакуум, 30 Г) и осажденне

50 мл воды дает хлопьевидный продукт, который очфильтровывают, промь вают водой и сушат над N ОН в глубоком вакууме. Очистка переосаждением из бензола гексаном; RI 0,36 в системе хлороформ — метанол (7: 3).

870 мг защищенного гексапептида растворяют в 15 мл 80 "р-ной уксусной кислоты, и раствор оставляют в течение 6 «ас при 30 С.

После этого упаривают в глубоком вакууме при 30 С досуха, остаток сушат в течение

1 час при 30 С, после чего прибавляют свободный от перекиси эфир и полученный порошок основа- ельно рас",ирают. Отфильтровывают, дополнглельно промывают большим количеством эфира и сушат.

Пример 3, БОК-цис-гли-асн-лей-сер(тбу)тре (тбу) -цис-мет-лей-гли-ОН.

1,0 г БОК-цис(три)-гли-асн-лей-ХН1х)Н2 растворяют в 20 мл диметилформамида и к охлажденному до — 10 С раствору прибавляют при перемешивании 1,5 мл 2,0 н. НС1 в этилацетате и 143 мг трет-бутилнитрита. После

15 мин при — 10 С прибавляют еще 10 мл

15 го

65 охлажденного до — 10 С диметилформамида, t,0 г мелкоразмельченного Н-сер (тбу) -тре (гбу) -цис (три) -мет-лей-гли-ОНХСОО1-1 и

400 мг М-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают под азотом в течение 1 час

;lðè — 10 С и в течение 48 час при 28 С.

11осле этого упаривают в глубоком вакууме до объема 6 мл и декапептидпроизводное осаждают приливанием 100 мл ледяной воды. Образующийся осадок растирают, отсасывают и сушат в вакуум-эксикаторе над едким натром. Продукт показывает при хроматографии на силикагеле RI 0,60 в хлороформе — метаноле (7: 3) .

300 мг БОК-цис(три)-гли-асн-лей-сер(тбу)тре (тбу) -цис- (три) -мет-лей-гли-ОН растворяют в 100 мл метанола и в течение 1 час прибавляют по каплям к хорошо перемешиваемому раствору 400 мг йода в 120 мл метанола. После окончания приливания перемешивают еще в течение 45 мин и обесцвечивают потом охлажденный до 0 С раствор 1 н. водным раствором тиосульфата натрия. После этого упаривают в вакууме до 10 мл и осаждают декапептидпроиз водное прил ив анием

100 мл холодного 1%-ного водного раствора уксусной кислоты. После растирания, фильтрования и промывания ледяной водой сушат продукт в эксикаторе над едким натром. Продукт для очистки подвергают противоточному распределени|о в системе метанол †буфе хлороформ — тетрахлорметан (10: 3: 5: 4) (буфер 29 мл ледяной уксусной кислоты и 19 г ацетата аммония, доведено водой до 1 л); содержащие производное декапептида фракции объединяют и раствор упаривают. Для удаления ацетата аммония растворяют продукт в хлороформе и раствор три раза промывают разбавленным раствором лимонной кислоты и три раза водой, после этого упаривают досуха.

Пример 4. Кбз-тре(тбу) -тир(тбу) -тре (тбу) -гли-асп (Отбу) -фел-асн - лиз (БОК) -фалгли-тре(тбу) -фал-про-глн - тре(тбу) -ала-нлегли-ОН.

2,30 г Кбз-тре (тбу) -тир (тбу) -тре (тбу) -глнасп(Отбу)-фал-NHNH растворяют в 35 мл диметилформамида и к охлажденному до — 20 С раствору прибавляют 3,5 мл 3 н. водной соляной кислоты по каплям. После этого прибавляют 2,7 мл 0,9 н. раствора нитрита натрия и оставляют реакционную смесь стоять в течение 20 мин при — 10 С. После этого прибавляют по каплям охлажденный до — 10 С раствор 1,72 г Н-асн-лиз (БОК) -фалгис-тре(тбу)-фал-про-глн — тре(тбу) - ала-илегли-ОНХСООН в 30 мл 90%-ного диметилформамида и 1,0 г N-метилморфолина. Оставляют смесь стоять в течение 18 час при 0 С, потом упаривают в глубоком вакууме и осаждают продукт добавлением 100 мл холодной

2%-ной лимонной кислоты. Осадок основательно растирают, отделяют центрифугированием, четыре раза дополнительно промывают маленькими порциями ледяной воды и сушат

417940

Г сн s

3 ч 6 6 т 6 9 10

3 — СН-СΠ— тли- аси-лей — cep-тге — цис-мет-лей-тли11 12 16 19 16 16 1т 18 19 е 2

0 21 — т! е — ти1 -тле — тли- асп- аал- асн- лиз- 4 ал — тис — тге— Фал-про-тлн-тve-ала-иле-.ли-вал-г.. .— а та-пг» -.,, 55

5 в вакуум-эксикаторе пад едким натром. Для очистки многократно переосаждают из диметилформамнда — этилацетатом.

Пример 5. 11-тре(тбу) -тир (тбу) -тре (тбу) -гли-асп (Отбу) - фал - асн-лиз (БОК)фал-гис-тре (тбу) -фал-про-глн - тре (тбу) -алаиле-гли-вал-гли-ала-про-КН .

800 мг Кбз-тре (тбу) -тир (тбу) -тре (тоу) -глнасп(Отбу)-фал-асн-лиз(БОК)-фал - гис - тре (тбу) -фал-про-глн-тре (тбу) -ала-иле - гли-ОН, 5!О мг Н-вал-гли-ала-про-ХН и 120 мг Х-гидроксисукци имида растворяют в 9 мл диметилформамида перемешиванием при 45 C и затем прибавляют 120 мг дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при 45 С в течение 12 час, причем через 3 и

7 час после начала реакции еще приоавляют по 20 мл дициклогексилкарбодиимида и 20 мг

N-гидроксисукцинимида. Потом выливают смесь в 200 мл этилацетата и мелкий осадок отфильтровывают. Для очистки подвергают продукт противоточному распределению в системе метанол — буфер — хлороформ — тетрахлор — метан (10: 3: 5: 6); приготовляют буфер по примеру 3.

227 мг полученного защищенного докозапептидамида растворяют в 10 мл 90О -ной уксусной кислоты и раствор гидриру1от в присутствии 100 мг палладиевой черни при интенсивном псремешивании.

После окончания поглощения водорода отфильтровывают катализатор и фильтрат упаривают досуха. Остаток растворяют в насыщенном водой бутаполе и раствор три раза промывают в делительной воронке небольшими порция и 5О/о-ного раствора карбоната натрия и два раза незначительным количеством воды. Затем упаривают раствор бутанола в высоком вакууме при 35 С и сушат остаток в высоком вакууме. Таким образом получают

185 м.; декарбобензоксилированного;1окозапептида. (Пример 6. БОК-цис-гли-асн-лей-сер (тбу)1 тре (тбу) -цис-мет-лей-гли-тре (тбу) - тир (тбу)тре(тбу) -глн-асп (Отбу) -фал-ac» - лиз (БОК)фал-гис-тре (тбу) -фал-про-гли - тре (тбу) -алаиле-гли-вал-гли-ала-про-NHq.

181 г БОК-цис-гли-асн-лей-сер (тбу) -тре

I (тбу)-цис-мет-лей-гли-ОН, 288 мг Н-тре(тбу)где R — Н, NHq или ацил — NH, или соответствующих соединений, в которых остатки аспарагина или глутам ша могут быть заменены остатками аспарагиновой или глутаминовой кислот, или остаток аспарагиновой кислоты может быть заменен остатком аспараги5 т0

Зо

6 тир (тбу) -тре (тоу) -глн - асп (Отбу) — фал-аснлиз(БОК) -фал-гис-тре(тбу) - фал-про-глу-трс (тоу) -ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-NH2 и

23 мг N-гидроксисукцинимида растворяют в

2 мл абсолютного диметилформамида при нагревании и после охлаждения до комнатной температуры прибавляют 31 мг дпциклогексилкарбодиимида. Пробирку затем заполняют азотом, закрывают ее и оставляют стоять в течение 15 час при 45 С. Отфильтровывают образовавшуюся кристаллическую дпциклогексилмочевину, промывают два раза 0,5 мл диметилформамида, фильтрат упаривают до половины его объема в высоком вакууме и продукт-сырец выделяют прибавлением 20 мл бензола и 120 мл петролейного эфира. Для очистки переосаждают из метанола бензолом и гексаном, отфильтровывают и сушат при

45 С до получения постоянного веса. Таким образом, получают защищенный дотриаконтапептидамид в виде аморфного порошка.

Пример 7. Н-цис-гли-асн-лей-сер-тре-цисмет-лей-гли-тре-тпр-тре-глн-асп-фал-асп — лизфал-гис-тре-фал-про-глн-тре-ала-иле-гли - валгли-ала-про-NH (кальцитонип М).

150 мг БОК-цис-глп-асн-лей-сер (тбу) -тре ! (тбу) -цис-мет-лей-гли-тре (тбу) - тир (тбу) -тре (тбу) -глн-асп (Отбу) -фал-асн-лиз (БОК) - фалгис-тре (тбу) -фал-про-глн-тре (тбу) — ала - илегли-вал-гли-ала-про-ХН. растворяют в 3 мл

95 /о-ной трифторуксусной кислоты, продувают азотом и оставляют стоять в течение 90 мин прп 25 С. Трпфторацетат освобожденного дотриаконтапептидамида после этого осаждают как аморфный порошок прибавлением 60 мл абсолютного эфира, отделяют центрифугированием, снова суспендируют в 0 мл эфира, еще раз центрифугируют, и остаток сушат при

30 С.

Аналогично получают асн 5-кальцитонин М, N" -ацетил-кальцитонпн М, дезамино-кальцитонин М, дезамидо-про -кальцитонин М, N-ацетил-кальцптонин М, N- -пальмитоил-кальпитонин М, N" -лаурил-кальцитонин-М.

Предмет изобретения

Способ получения гипокальпемическпх пептидов общей формулы

0В, отличающийся тем, что пептид из не менее семи первых амн Ioêèñëoòø.1х остатков, содержащий дисульфидный мостик, конденсируют обы 01ым методом с применением защитных групп для всех или части МН вЂ”, OH — и СООН-групп, с пептидом, содержащим

417940

Составитель В. Кривцов

Техред Г. Васильева

Корректор О. Тюрина

Редактор Л. Герасимова

Заказ 1563/14 Изд. № 1327 Тираж 506 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 5К-35, Раугцская паб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 остальные аминокислоты до аминокислоты 32, с последующим удалением защитных групп под действием кислоты, например трифторуксусной, и целевой продукт выделяют известными методами.