Патент ссср 430546

 

О П И -С.-А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ и1 430546

Союз Советских

Социалистических

Республик *

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 14.10.69 (21) 1370715/23-4 (51) М. Кл, С 07с 103 52 (32) Приоритет 15,10.68 (31) 15401/68 (33) Швейцария

Опубликовано 30.05.74. Бюллетень № 20

Государственный комитет

Совета Министров СССР но делам изобретений и открытий (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) Дата опубликования описания 30.10.74 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Вернер Риттел, Макс Бруггер, Бруно Камбер, Бернхард Риникер, Петер Зибер (Швейцария) и

Хендрик Мари Гревен (Голландия) Иностранная фирма

«Циба-Гейги АГ» (Швейцария) (»I) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПОКАЛЪЦЕМИЧЕСКИХ

ПЕПТИДОВ

Изобретение относится к области получения новых пептидов, которые могут найти применение в качестве эффективных гипокальцемических препаратов.

Предлагаемый способ позволяет получать пептиды, структура которых близка структуре человеческого тиреокальцитонина.

Получаемые таким образом пептиды отличаются от человеческого тиреокальцитонина лишь наличием в положении 8 других аминокислотных остатков вместо метионина, а именно 1 -валина, 1 -норвалина, L-лейцина, 1 -изолейцина, 1-норлейцина и L-а-аминомасляной кислоты. Замещение остатка метионина на более стабильные остатки приводит к упрощению синтеза, но конечные пептиды обладают биологической активностью, не меньшей, чем человеческий тиреокальцитонин, что весьма ценно.

В соответствии с изобретением предлагаемый способ заключается в получении гипокальцимических пептидов общей формулы

1 1 цис-гли-асн-лей-сер-тре-цис-Х-лей - гли третир-тре-глн-асп-фал-асн-лиз-фал-гис-тре - фалпро-глн-тре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про - NH>, где Х вЂ” L-валин, L-норвалин, L-лейцин, L-изо-лейцин, L-но рлейцин, L-а-аминомасляная кислота, а также их N" -ацил- и N" -дезаминопроизводных, и отличается тем, что указанные пептиды получают конденсацией фрагментов 1 — 7, 1 — 8, 1 — 9 или 1 — 10, содержащих дисульфидный мостик, с фрагментами

8 — 32, 9 — 32, 10 — 32 или 11 — 32 соответствен10 но, с последующим удалением защитных групп и выделением целевых продуктов известными способами.

Пример 1. Кбз-тре-тир-тре-глн-асп- (отбу)фал-асн-лиз- (бок) -фал-гис-тре-фал — про - глн15 тре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-NH2.

Растворяют 7,3 r кбз-тре-тир-пре-глн-асп(отбу) -фал-асн-лиз- (бок) -фалон в 75 мл диметилформамида, прибавляют 1,33 r N-гидроксисукцинимида и охлаждают раствор до — 22 С.

20 Прибавляют охлажденный раствор 1,195 r дициклогексилкарбодимида в 15 мл диметилформамида (раствор А). После пе ремешивания в течение 1 час при — 22 С и 5 час при

+4 С опять охлаждают раствор до — 22 С.

2s Далее прибавляют к раствору А доведенный

430546

65 триэтиламином до рН 6,7 — 7 и охлаждают раствор 6,9 г и-гис-тре-фал-про-глн-тре-алаиле-гли-вал-гли-ала-про-NH в 80 мл диметилформамида. Спустя 14 дней прибавляют суспензию к новому раствору А, приготовленному из 0,73 г защищенного нонапептида. Оставляют еще на 7 дней при 0 С, фильтруют после этого суспензию и упаривают фильтрат в вакууме досуха. Остаток очищают хроматографией на колонке из силикагеля в системе и-бутанола — ледяной уксусной кислоты — воды (4: 1: 5).

Пример 2. и-Тре-тир-тре-глн-асп- (отбу)фал-асн-лиз- (бок) -фал-гис-тре-фал-про - глнтiре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-NH>.

Растворяют 2 г описанного в примере 1 продукта в 150 мл диметилформамида и гидрируют. После 2 / час прибавляют 0,3 мл

4,844 н. соляной кислоты. После 21 час фильтруют и упаривают фильтрат. Остаток растворяют в 25 мл диметилформамида, прибавляют

0,73 мл 1,0 н. соляной кислоты, перемешивают с 40 мл этилацетата и охлаждают до 0 С. Осадок отфильтровывают, растворяют его в третбутаноле — воде и лиофильно высушивают.

Продукт показывает (а),,Π— 25,2 (с=2 в диметилформамиде) .

Пример 3. Бок-гли-асн-лей-сер-тре-цис(бзл) -N Н -кбз.

9,2 г и-цис- (бзл) -N H -кбз растворяют в

300 мл перегнанного диметилформамида, к нему прибавляют 12,2 r бок-асн-лей-сертре-ОН и перемешивают при комнатной температуре до растворения. Раствор затем охлаждают до 0 С, прибавляют 3,28 г триэтиламина и 4,88 г N-гидроксисукцимида в 100 мл диметилформамида, продолжают охлаждать до — 22 С и прибавляют 4,36 r дициклогексилкарбодиимида в 30 мл диметилформамида, Перемешивают 1 час при — 22 С, повышают затем температуру постепенно и перемешивают еще 3 дня при комнатной температуре, отфильтровывают выпавшую дициклогексилмочевину и фильтрат упа ривают досуха в высоком вакууме. Остаток растирают в смеси этилацетата и 5О/о-ной лимонной кислоты, осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат в вакууме, растирают в сухом эфире, отфильтровывают и сушат в высоком вакууме; т. пл. 173 — 178 С; (n) — 25,5 (c=2 в диметилформамиде) .

Пример 4. н-Гли-асн-лей-сер-тре-цис(бзл) -N H -кбз, ТФА.

13 r бок-гли-асн-лей-сер-тре-цис- (бзл) -,NqHqкбз растворяют в 130 мл 90 /о-ной ч1рифторуксусной кислоты и раствор оставляют стоять

2 час при 22 С. Раствор затем концентрируют и остаток растирают три раза с эфиром и сушат в вакууме над едким натром; т. пл. 159—

161 С.

Пример 5. Бок-цис- (бзл) -гли-асн-лей-сертре-цис- (бзл) -N Í -кбз.

6,69 г бок-цис- (бзл) -осу и 12,2 r и-гли-асилей-се р-тре-цис- (бзл) -N Н -кбз растворяют в

100 мл диметилформамида. Раствор 150 м мол триэтиламина в 100 мл диметилформамида прибавляют по каплям при перемешивании, пока реакционная смесь на мокрой индикаторной бумажке не покажет рН=значение 6,4, Раствор перемешивают 3 дня при комнатной температуре, затем упаривают в высоком вакууме досуха. Остаток два раза перемешивают с 300 мл этилацетата, затем три раза с смесью

150 мл этилацетата и 30 мл 5 /о-ного раствора лимонной кислоты, отфильтровывают, сушат в вакууме и перекристаллизовывают из диметилформамида — этилацетата; т. пл. 191—

193оС. (n) o — 31,5 (с=2 в диметилформамиде) .

Пример 6. Бок-цис-гли-асн-лей-сер-трецис-М Н, 6 r бок-цис- (бзл) -гли-асн-лей-сер-тре-цис(бзл) -N H -кбз растворяют п ри — 40 С в

700 мл сухого жидкого аммиака. При перемешивании прибавляют 973 мг натрия так, что цвет реакционной смеси изменяется только в голубой. 25 мин спустя восстановление окончено. Продолжают перемешивать 10 мин при сохранении голубого цвета, прибавляют затем

2,4 мл этилацетата и упаривают досуха, Остаток растирают с 12 мл воды, 3,2 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл этилацетата в течение 1 час при 0 С, осадок отфильтровывают, промывают два раза 10 мл 1О/О-ного раствора уксусной кислоты и раз 10 мл этилацетата сушат в высоком вакууме.

Пример 7. Бок-цис-гли-асн-лей-сер-тре-! цис-N:Н,.

1,0 r бок-цис-гли-асн-лей-сер-тре-цис-N H растворяют в 100 мл диметилформамида и

500 мл воды, содержащей 1,23 м.экв. НС1, рН раствора доводят до 6,8 при помощи 3,7 мл

0,43 н. раствора гидроокиси калия. При сохранении этого рН-значения в течение 90 мин прибавляют по каплям при перемешивании одновременно 247 мл 0,01 н. раствора феррицианида калия и 4,9 мл 0,43 н. раствора гидроокиси калия. Продолжают перемешивать

90 мин при комнатной температуре и затем рН-значение раствора доводят до 4,0 при помощи 0,7 мл ледяной уксусной кислоты. Потом раствор перемешивают с 50 мл Дауэкс-2Х8, ацетатформа, затем с 13 мл Дауэкс-50-Х8, Н+-форма, отфильтровывают и выпаривают досуха. Остаток растворяют в 50 /о-ном третбутаноле, лиофилизируют и сушат в высоком вакууме.

П р и м е ip 8. Бок-нле-лей-гли-оет.

Из 4,63 r бок-иле-ОН, 2,82 мл триэтиламина и 1,9 мл этилового эфира хлормуравьиной кислоты в 50 мл тетрагидрофурана приготовляют смешанный ангидрид, соединяют его с 5,05 г н-лей-гли-оет, НС1 в 50 мл тетрагидрофурана, Продукт перекристаллизовывают из этилацетата — петролейного эфира (40: 60); т. пл.

126 — 127 С; (а) ро — 28,3 (с=1 в диметилформамиде) .

430546!

12. Бок-цис-гли-асн-лей-сер-треПредмет изобретения

Составитель В. Кривцов

Редактор Л. Герасимова Техред 3. Тараненко Корректор 3. Тарасова

Заказ 2864/18 Изд. № 1728 Тираж 506 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, )К-35, Раушская наб., д, 475

Типография, пр, Сапунова, 2

П р и и е р 9. Бок-иле-лей-гли-ОН.

Растворяют 3,25 г описанного в примере 8 защищенного трипептида в 100 мл метанола и прибавляют 21 мл 0,53 н. гидроокиси натрия.

После полуторачасового перемешивания раствор подкисляют и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в воде и экст1рагируют этилацетатом. Органический слой сушат и упаривают. Продукт плавится при 71 — 72 С; ((x)pо—

28,4 (с =-1 в диметилформамиде) .

Пример 10. Нле-лей-гли-ОН.

Растворяют 2,42 г бок-нле-лей-гли-ОН в

24 мл 90%-ной трифторуксусной кислоты, 1 час спустя раствор упаривают. Продукт плавится п ри 94 — 96 С.!

Пример 11. Бок-цис-гли-асн-лей-сер-тре-! цис-нле-лей-гли-ОН.

Растворяют 1 г описанного в примере 7 гидразида в 35 мл диметилформамида и получают азия при помощи 0,85 мл 3,64 н. соляной кислоты в тетрагидрофуране и 0,155 мл изоамилнитрита. Азидный раствор прибавляют к раствору 0,955 г нле-лей-гли-ОН и 0,324 r триэтиламина в 25 мл диметилформамида. Реакционную смесь упаривают и перемешивают два раза с этилацетатом — раствором лимонной кислоты.

Пример ! цис-нле-лей-гли-тре-тир-тре-глн - асп — (отбу)фал-асн-лиз- (бок) -фал-гис-тре-фал — про - глнтре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-NH,.

Растворяют 440 мг описанного в примере 11 бок-декапептида и 109 мл N-гидроксисукцинимида в 35 мл диметилформамида, раствор охлаждают до — 22 С, прибавляют 98 мг дициклогексилкарбодиимида и перемешивают еще

1>/2 час при — 22 С и 3 /2 час при 0 С. Потом опять охлаждают до — 22 С, прибавляют

850 мг описанного в примере 2 докозапептидамида и доводят рН до 6,6 при помощи триэтиламина. После 7 дней при 0 С и 5 дней при 22 С раствор упаривают досуха в вакууме, и остаток хроматографируют через силикагель в системе и-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (4: 1: 5) .

I 1

Пример 13. н-Цис-гли-асн-лей-сер-тре-циснле-лей-гли-тре-тир-тре-глн-асп-фал - асн-лизфал-гис-тре- фал-про-глн-тре-ала-иле-гли - валгли-ала-про-NH2- (нле -кальцитонин М).

500 мг порошкооб разного бок-цис-гли-асн5 лей-сер-тре-цис-нле-лей-гли-тре-тир - тре - глнасп- (отбу) -фал-асн-лиз- (бок) — фал - гис — трефал-про-глн-тре-ала-иле-гли-вал-гли-ала - проNH> прибавляют при интенсивном перемешивании к 10 мл охлажденной концентрированной соляной кислоты. После 10 мин прибавляют при температуре 0 С 50 мл воды и 5 мл ледяной уксусной кислоты и раствор фильтруют через колонку с мерк-ионообменником

¹ 1111, слабоосновным в ацетатной форме, чтобы удалить хлор-ионы. Затем при добавке к-октанола выпаривают на роторном испарителе. остаток декантацией несколько раз промывают петролейным эфиром, чтобы удалить октанол, высушивают, растворяют в 0,1 н. муравьиной кислоте и хроматографируют на колонке (3,8 см,х, 120 см) с био-гелем-Ра. Собирают фракции по 10 мл. Чистоту этих фракций проверяют при помощи тонкослойной хроматографии на окиси алюминия. Соответствующие фракции соединяют и лиофильно высушивают.

Аналогично получают вал -кальцитонин М, лей -кальцитонин М, и-вал -кальцитонин М, 30 абу -кальцитонин М, гли 2 "-кальцитонин М.

Способ получения гипокальцемических пептидов общей формулы

1 цис-гли-асн-лей-сер-тре-цис-Х-лей-гли-тре -тиртре-глн-асп-фал-ас»-лиз — фал-гис-тре-фал-про40 глн-тре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-NH, где Х вЂ” 1-валин, 1-норвалин, 1 -лейцин, L-изо-лейцин, L-норлейцин- или L-и-аминомасляная кислота, а также их N" -ацил- и N -дезаминопроизводных, отличающийся тем, 45 что указанные пептиды получают конденсацией фрагментов 1 — 7, 1 — 8, 1 — 9 или 1 — 10, содержащих дисульфидный мостик, с фрагментамп 8 — 32, 9 — 32, 10 — 32 или 11 — 32 соответственно, с последующим удалением защитных

50 групп и выделением целевых продуктов известными методами.