Способ получения пептидов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К йАТЕНТУ («) 439088

Союз Советских

Социалистических

Ре сп 6тти к (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. С 07с 103/52 (22) Заявлено 21.10.70 (21) 1486904/1758011/

/23-4 (32) Приоритет 22.10.69 (31) 15786/69

03.07.70 10146/70 (33) Швейцария

Опубликовано 05.08.74. Бюллетень № 29 ос/дарственный комитет

Сова а Министров СССР по делаы иэооретений н откоытий (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) Дата опубликования описания 24.03.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Макс Bpyrrep, Бернхард Риникер и Вернер Риттель (Швейцария) Иностранная фирма (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ

СН,— S

11 2 3 4 5 б 7 Н

К вЂ” СН вЂ” СΠ— znu — а сн — лей — cep — mpe — u uc — Х—

9 10 11 12 13 14 15 10 17 18 — neu — гли — mpe — mup- птрг — глн - асп — pea-асн-лаз19 20 21 22 23 24 25 2б 27 28 — (/)бн — гас - mpe — pee — пра — глн — mpe - ала — une — гли29 30 31 32 — 8an- гли — ала — про -NHz

Изобретение относится,к способу получения новых пептидов, аналогов тиреокальцитони на человека, обладающих высокой биологической активностью. где R — водород, свободная или ацилированная аминогруппа;

Х вЂ” остаток 1 -метиони на, 1 -валина, 1 -,норвалина, 1 -лейцина, 1 -изолейцина, 1 -.норлейцина или 1-а-аминомасляной кислоты и где по меньшей мере одна из аминокислот замещена в положениях 11, 12, 16, 17, 19, 20, 22;и 24 другой аминокислотой, а имен но 1-треонин"

Предлагается основанный на широко известном в химии пептидов методе окисления свободных или защищенных тритильной группой меркаптогрупп до дисульфидов способ по5 лученья пептидов общей формулы

1-лизином, 1-тирозин1е 1-лейци ном, 1-фенилаланин" L-лейцином, L-аспарагиновая кислота" L-гистиди ном, L-фенилаланин" L-лейцином, L-гистидин о L-глутамином, L-фенилала10 нин" L-тирозином и 1 -глутамин 4 1 -аргинином.

Способ заключается в том, что соединение общей формулы

439088

Щ (1 2. Ь Ч 8 В 7 8 9

8 — СК- СΠ— znu — ace — neu — сер- mpe-и,ис — Х вЂ” лей.—

10 11 12 15 19 15 18 17 18 19 — глн — mpe — л7цр — mpe — глн- аеп — рен — исн -nuB -pea—

20 21 22 25 2 25 26 27 28 29 — 2vc — пре — peff — ape — глн -тре — ила -але —.ълн — Ьил—

30 51 52 — znv — ana — npv -7Hz где R и Х имеют указанные, выше значения, .по меньшей мере одна из аминокислот замеще на в положениях 11, 12, 16, 17, 19, 20, 22 и

24 вышеуказанными аминокислотами и меркаптогруппы свободны или замещены тритиль- 5 ной группой, окисляют до дисульфидов.

Окисление можно провод ить известным clloбом с помощью ферроциан ида в водном растворе,или йодом,,или воздухом в жидком ам- 10 миаке. Меркаптогруппы, защищенные тритильной группой, можно окислять йодом, например, в метаноле.

Целевые продукты выделяют в свободном виде или в виде кислотно-аддитив ных солей, 15 или комплексов известными приемами.

I I

Пример. Н-цис-гли-асн-лей-сер-тре-цис-мет-лей-гли-тре-лей-тре-глн-асп-лей-асн — лиз-лей-lmc-тре-фен-про-гл н-тре-ала-иле-гли - вал- 20

-гли-ала-про-ИНг, лей 2 " -кальцитонин М.

77 мг трифторацетата Н-цис (ТРИ) -гли-аси-лей-сер-тре-цис (ТРИ) -мет-лей-гли-тре-лей-тре-глн-асп-лей-аон-лиз-лей-гис-тре-фен — про-глн-тре-ала-,иле-гли-вал-гли-ала-про-ХН2 рас- 25 творяют в 20 мл 95%-ной уксусной кисловаты и полученный раствор прикапывают в тече ние

1 час к интенсивно перемешиваемой смеси

100 мг йода и 120 мл 95%-ной уксусной кислоты. Затем смесь перемешивают еще 2 час 30 при,комнатной температуре, после чего прибавляют 200 мл воды и экстрагируют,избыточный йод путем встряхивания с порциями по 100 .мл тетрахлормета на, пока îí iHe станет бесцветным. Далее водный раствор подве рга- 35 ют лиоф ильной сушке, остаток растворяют в

5% -ной уксусной кислоте и фильтруют через колонну с ионообменником Мерк ¹ 11 (слабоосновной, форма ацетата), Злюат подвергают лиофильной сушке и получают ацетат 40 лей" " "- кальцитон и на М, который в случае необходимости можно освободить,от нез начительного количества загрязнений путем противоточ ного распределения в системе н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода 45 (4: 1: 5 об. ч.) .

Исходный продукт мож но получить следующим способом.

183 мг БОК-цис (ТРИ) -гли-асн-лей-сер (тБу)-тре (тБу) -цис (ТРИ) -мет-лей-гли-ОН, 22 мг 50

N-оксисукцинимида и 377 мг защищенного докозапептидамида Н-тре (тБу) -лей-тре (тБу)-глн-асп (ОтБу) -лей-аон-лиз (БОК) -лей-гис-тре (тБу) -фен-про-глн-тре (тБу) -ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-ИН2 и 10 мл деметилформамида перемешивают в течение 30 мин при

50 С, реакционную смесь охлаждают до 40 С и прибавляют к .ней 45 мг дициклогексилкарбодиимида. Затем смесь перемешивают 18 час при 40 С,,охлаждают до 0 С,и выливают в

200 мл простого эфира, свободного от перекиси. Осадок фильтруют, высушивают и растворяют в смеси диметилформамид —.метанол (1: 1) . Раствор фильтруют через колон ну (высота 100 см, диаметр 4 см) с Сефадексом

LH-20, приготовленным в той >ке смеси. Фракции ооъемом 5 мл улавливают, упаривают досуха IlpH остаточном давле нии 11 мм рт. ст. и затем при 0,01 мм рт. ст. и температуре бани

45 С и проверяют чистоту полученных фракций с помощью тонкослойной хроматографии на силикагелевых пластинах. Получают БОК-цис (ТРИ) -гли-асн-лей-сер (тБу) -тре (тБу)-цис- (ТРИ) -мет-лей-гли — тре (тБу) - лей - тре (тБу) -глн-асп (ОтБу) - лей - асн - лиз (ВОК)-лей-гис-тре(тБу) -фен-про-глн-тре(тБу) - ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-N Нг.

135 мг полученного продукта растворяют в

5 мл трифторуксусной кислоты, раствор выдерживают 1,5 час при комнатной температуре, затем добавляют к нему 30 мл трифенилкарби|нола и выдерживают 10 мин, после чего упаривают на ротационном испарителе досуха при температуре бани 30 С и остаток растирают с,простым эфиром, не содержащим перекиси. Полученный порошок фильтруют, тщательно промывают простым эфиром и высушива1от в вакууме над едким натром. Получают 87 мг трифторацетата Н-цис(ТРИ)-гли-асн-лей-сер-тре-цис (ТРИ) -мет-лей - гли—

-тре-лей-тре-глн-аоп-лей-аон-лиз-лей-,гис - тре-фен-про-глн-тре-ала-иле-гли-вал-гни-ала-про-ХН2, кот орый для дальнейшей переработки достаточно чист.

Лналогич но получают; тир 2-кальцитонин М; лиз", apl"-кальцито нин М; гис17, лей1, глн о-кальцитонин М; вал, тир"-кальцитонин М; вал", лей" " "-кальцито!ни и М; дезаMHIIQ-лей" " "- кальцитонин М; дезамино-TiHp кальцитон ин М; дезамино-вал -лей" " "-кальцито|ни|н М;

439088 лей - -кальцитонин М; лей "-кальцитони н М; лей"-кальцитон10н М.

Предмет изобретения

СН, б

11

2 3 М 5 0 7

11.— .Н вЂ” СΠ— гЛа — аСН вЂ” Лги — Cep — mpe -- циС вЂ” Х9 10 11 12 15 1й 15 15 17 15 — лгй — гли — mpe — mup-тпе — глн — асн — рен — асн-nu.;—

19 20 21 22 23 2Ь 25 20 27 20 — pekoe — гис- mpe — pen-.чра -глн-mpe-апа-иле- гпи

29 50 51 32 — 9an- гли- ала-пра -NHz

SH

СН2

li 3 ч. 5 б 7 6 9

К вЂ” СК вЂ” СО - гли - асн-леи - cep=-mpe — uuc -X — nea—

10 11 12 13 14 15 15 17 18 19 — гли - тре — mup -mpe — глн- аса- шен — асн - — iud - рен—

20 21 22 25 2 ; 25 20 27 28 29 — zuc-и ре — pen — пуа- глн-mpe ала — cine — гли — бал—

50 31 52 — гпа — ола — cpa — 11 Н2

Приоритет ио признакам; вал -лей" б 9 тир -кальцито нин М; дезам,ино-вал лей " "-тир"-кальцито нин М;

Способ получения пептидов общей формулы где R — водород или свободная илн ацилированная аминогруппа;

Х вЂ” остаток 1 -метионина, 1 -валина, 1 -норвалина, L-лейцина, L-изолейцина, L-норлейцина или L-а-аминомасля ной кислоты и где по меньшей мере одна из аминокислот замещена в положениях 11, 12, 16, 17, 19, 20, 22 и 24 другой аминокислотой, а именно L-треонин" где R и Х,имеют указанные выше значения, по меньшей мере одна из аминокислот замещена в полохке01иях 11, 12, 16, 17, 19, 20, 22 и

24 вышеуказанными аминокислотами и меркаптогруппы свободны или защищены тритильной группой, окисляют до дисульфидов с последующим выделением целевых продуктов

:в свободном виде или в виде кислотно-аддигивиых солей, или комплексов известными приемами.

22.10.69 при R — водород, амино- или ациламиногруппа; Х вЂ” ooTàòo ê L-метионина и где ио меньшей мере одна,из аминокислот в положениях 11, 12, 17, 19, 20, 22 и 24 замещена

1 -лизином, 1 -тирозин" 1 -лейцином, 1 -фенилаланин" 1.-лейцином, 1.-аспарагиновая кислота" 1 -гистидином, 1 -фенилаланин 9 1 -лейцином, L-гистидин 1 -глутамином, 1 -фенилаланинР 1 -тирозином и 1 -глутамин 4 L-аргини10 ном, отличающи йся тем, что соединение общей формулы другой ам1п1ок ислотой, а именно 1 -треонин"

1 -лизином, 1 -тирози н" 1 -лейцином, 1 -фенил15 алании" 1 -лейцином, 1 -аспарагиновая кислота" 1 -гистидином, 1 -фенилаланин" 1 -лейцином, 1 -гистидин о 1 -глутамином, L-фенилаланин" 1 -тирози ном, 1 -глутамин " 1 -аргинином.

03.07.70 при R — водород, аминогруппа;

20 Х вЂ” остаток 1 -валина, 1 -,норвалина, 1 -лейцина, 1-,изолейцина, 1-;норлейцина или 1 -к-аминомасляной кислоты и где по меньшей мере одна,из аминокислот замещена в положениях ! 1, 12, 16, 17, 19, 20, 22 и 24 другой амино25 кислотой, а именно 1 -треонин" L-лизином, 1 -тирозин" 1 -лейцином, L-фенилаланин"

L-лейцином, L-аспарагиновая кислота" L-гистидином, 1 -фенилаланин" 1 -лейцином, 1 -гистиднн-" 1-глутами|ном, 1-фенилала ни н" 1-ти30 розином, 1 -глутамин" 1 -аргинином,