Способ получения пенициллинацилазы

 

САН ИЕ ,1 11 451249

ОП И

Союз Советских

Социалистических

pl3Q5PET EH HSI

К ПАТЕНТУ

Республик (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. С 07g 7/028 (22) Заявлено 12.10.72 (21) 1836202/31-16 (32) Приоритет 14.10.71 (31) P 2151236.7 (33) ФРГ

Опубликовано 25.11.74. Бюллетень № 43

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 615.779.94 (088.8) ло делам изобретений и открытий

Дата опубликования описания 24.09.75 (72) Автор изобретения

Иностранец

Карл Кутцбах (ФРГ) Иностранная фирма

«Байер АГ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЪ|

Изобретение относится к фармацевтической промышленности.

Известен способ получения,пенициллинацилазы, заключающийся в том, что клетки Е. coli разрушают, высаливают целевой продукт из сырого экстракта сульфатом аммония и хроматографируют па карбоксиметилцеллюлозе и диэтиламиноэтилцеллюлозе. Однако выход целевого продукта невысок.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта и повышение его качества.

Для этого рН экстракта доводят до 3,5 — 5,5, отделяют осадок и хроматографируют на cl>ликатах алюминия, например на бентоните, и кристаллизуют целевой продукт в присутствии сульфата аммония.

П р и мер 1. Культуру E. со11 выращивают известным способом, центрифугируют до густой суспензии, добавляют 3%-HbIH метилизобутилкетон, доводят рН до 7,5, размешивают

t:åñêoëüêo часов и получают сырой экстракт, 90 г которого подкисляют до рН 5,0 и центрифугируют. К 80 л образовавшегося прозрачного раствора (62000 ед., специфическая активность 0,25 ед/мг) добавляют ионообменник (Lcivatit () М 600 и S 100), обессоливают до 1,5, отфильтровывают ионообменник, доводят рН до 5,0, добавляют 350 г бентонита, размешивают 30 мин, отделяют бентонит в центрифуге, вымывают его 5 л 0,5 М натрийфос5 фатного буфера при рН 8,0, фильтруют и получают 5,2 л элюата (40000 ед. (65%), специфическая активность 1,45 ед/мг).

Часть элюата (9000 ед) обессоливают фильтрацией па геле, доводят рН до 5,0 и подают

10 на колонку, заполненную сефадексом SE, обработанным 0,05 Ч ацетатом натрия (рН 5,0).

В качестве элюента используют 4 л 0,07 М и

0,25 М ацетат натрия (рН 5,0). К объединенным активным фракциям (8100 ед. (90%) )

15 добавляют сульфат аммония до 70%-ного насыщения. К концентрированному раствору энзима (специфическая активность 5,8 ед/мг) добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до — 50%-ного насыщения, центрифу20 гируют и выдерживают несколько дней при

40 С, наблюдая кристаллизацию.

П р и мер 2. 60 л переведенного в растворимую форму сырого экстракта центрифугируют при рН 5,0, отделяют прозрачный рас25 твор (92000 ед, специфическая активность

0,45 ед/мг), обессоливают ионообменником, при рН 5,0 добавляют 150 г бентонпта, отделяют его центрифугированием, добавляют еще

451 249

3

200 r бентонита, отделяют аналогичным образом и вымывают 5 л 1 М ацетата натрия при рН 8,0. Элюат (51000 ед. (53 ), специфическая активность 1,8 ед/мг) обессоливают фильтрацией на геле и после хроматографирования на сефадексе SE получают раствор чистых энзимов, который концентрируют, смешивают с насыщенным раствором сульфата аммония и кристаллизуют пенициллинацилазу, как в примере 1.

Пример 3. Переведенный в растворимую форму сырой экстракт, полученный из 2900 л культуры Е. coli, центрифугируют при рН 5,0, 256 л чистого раствора (150000 ед., специфическая активность 0,32 ед/мг) разбавляют водой до 920 л, добавляют l,кг бентонита, размешивают 1 час, отделяют центрифугированием. Вымывают 0,5 М ацетатом натрия при рН 8,0 и получают 6,9 л раствора (62000 ед., специфическая активность 1,2 ед/мг). Вторым промыванием бентонита 0,5 М фосфатом натрия получают 9,8000 ед, Общий выход 47 /о.

Элюат (47000 ед,) обессоливают фильтрацией на геле, доводят рН до 5,0 и подают

-400 мл влажного сефадекса SE, обработанного 0,05 М ацетатом натрия (рН 5,0), адсорбируют сефадекс SE, гель отфильтровывают и вводят в колонку диаметром 5 см, содержащую 1600 мл свежего сефадекса SE в

0,05 М ацетата натрия (рН 5,0). Затем вымывают линейным градиентом из 4 л 0,07 M u

4 л 0 25 М ацетата натрия, рН 5,0. Соединенные активные фракции содержат 36000 ед. чистого энзима со специфической активностью

5,3 ед/мг.

Раствор чистого энзима концентрируют и осторожно добавляют твердый сульфат аммония до наступления легкого помутнения. Кристаллизация происходит при 4"С через несколько дней.

Пример 4. Сырой экстракт из клеток

Е. coli концентрируют центрифугированием в густую суспензию и клетки известными способами, а в случае необходимости добавлением 3 /о-ного метилизобутилкетона переводят в растворимую форму.

610 л сырого экстракта (1,3 10 ед.) разбавляют деионизированной водой до 2100 л, доводят значение рН до 5,0 серной кислотой, центрифугируют и получают прозрачный раствор (1,42 10 ед., специфическая активность

0,42 ед/мг). При рН 5,0 добавляют 13,8 кг бензонита и через 30 мин отделяют в проточной центрифуге. Отделенный бентонит вымывают

90 л 0,5 М раствора ацетата натрия, доводя рН до 8,0, отфильтровывают, получая 92,5 л раствора (1,12.10 ед. (86 ), специфическая активность 1,64 ед/мг).

1 л элюата диализируют в присутствии

0,001 М калийфосфатного буфера при рН 7,0.

Раствор энзима (8250 ед., специфическая активность 1,8 ед/мг) пропускают через колонку, элюируют 2 л 0,01 М и 2 л 0,1 М бу5

4 фера при рН 7,0, собирая фракции по 25 мл.

Пенициллинацилаза содержится во фракциях

110 — 170 С (1,2 л, 6760 ед. (82 ), специфическая активность 6 ед/мг).

Раствор осаждают твердым сульфатом аммония (472 г/л), осадок отделяют центрифугированием и растворяют в воде. Часть раствора (4700 ед.) разбавляют сульфатом аммония до 46 /О-ного насыщения, отделяют центрифугированием до прозрачности и сохраняют при комнатной температуре. В течение недели выпадают кристаллы, их центрифугируют, растворяют в 0,01 М фосфорного буфера и диализируют с тем же буфером (3300 ед. (70%), специфическая активность 12,45 ед/мг).

Пример 5. 60 л переведенного в растворимую форму сырого экстракта доводят до рН

5,0 и центрифугируют.

К отстоявшемуся прозрачному раствору (155000 ед., специфическая активность

0,3 ед/мг) добавляют ионообменник и обессоливают. В этот раствор при рН 5,0 добавляют сначала 200 г бентонита, отделяют центрифугированием и выбрасывают, затем добавляют еще 800 г бентонита, центрифугируют и вымывают 20 л 0,5 М ацетата натрия (рН 8,0).

Раствор энзима (110000 ед., специфическая активность 1,5 ед/мг) диализируют в присутствии 0,5 М натрийацетатного буфера, доводят рН до 5 0 и подают на колонку, заполненную сефадексом SEC-50, обработанным 0,5 М ацетатом натрия (рН 5,0). В качестве элюента используют 15 л 0,07 М и 15 л 0,25 М ацетата натрия, (рН 5,0). Активные фракции (88000 ед. (80%), специфическая активность

4,2 ед/мг) (29000 ед.) этого раствора диализируют в присутствии 0,01 М калийфосфатного буфера (рН 7,0) и подают на колонку с сефадексом А-50 в 0,01 М фосфата калия, рН 7,0.

В качестве элюента используют 0,01 — 0,1 М фосфата калия (рН 7,0), затем вымывают пенициллинацилазу (21000 ед. (73%), 11,2 ед/мг специфическая активность). Часть раствора (6000 ед.) доводят твердым сульфатом аммония до — 45 /о-ного насыщения. Через две недели на стенках сосуда образуются большие кристаллы. Еще через две недели при комнатной температуре кристаллы отделяют на центрифуге и небольшое количество растворяют в воде (4260 ед. (71О/о), специфическая активность 13,1 ед/мг).

Пример 6. Элюат бентонита, полученный как в примере 4 (4100 ед., 2,0 ед/мг) диализируют в присутствии 0,05 М ацетата натрия (рН 5,0) и подают на колонку с Lewatit

S P — 100 — Na+.

В качестве элюента используют 0,05 — 0,5 М ацетата натрия, (рН 5,0). Активные фракции (2020 ед. (56% ), специфическая активность

6,6 ед/мг) энзима доводят с едким натром до рН 6,5, насыщают твердым сульфатом аммония до 48 /о и кристаллизуют чистый энзим (1250 ед. (62 о/о ), специфическая активность

12,1 ед/мг), Предмет изобретения

Способ получения пенициллинацилазы путем разрушения клеток E. coli, выделения целевого продукта из сырого экстракта и очистки хроматографическими методами, отличающийся тем, что, с целью повышения

451249

6 выхода и качества целевого продукта рН экстракта доводят до 3,5 — 5,5, отделяют осадок, хроматографируют на силикатах алюминия, например на бентоните, и кристаллизуют

5 целевой продукт в присутствии сульфата аммония.

Составитель Т. Головина

Техред А, Дроздова

Редактор Д. Пинчук

Корректор Л. Орлова типография, пр. Сапунова, 2

Заказ 2144/16 Изд. № 660 Тираж 506 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Я-35, Раушская наб., д. 4/5