Способ получения иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы

 

ОП ИСАНИ Ё

ИЗОБРЕТЕНИЯ ти1 4983l5

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 23.01.74 (21) 1989378, 28-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 05.01.76. Бюллетень № 1

Дата опубликования описания 08.04.76 (51) М, K,ë. - С 07G 7/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 577.15.08 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения (71) Заявители

В. П. Кумарев, А. С. Райт, В. К. Райт и В. В. Хомов

Новосибирский государственный университет и Специальное конструкторско-технологическое бюро биологических активных веществ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ

ПОЛ И Н УКЛ ЕОТ ИДФО СФОР ИЛАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, в частности к получению иммобилизованных ферментов.

Известен способ получения иммобилизованной полинуклеотидфосфорил азы путем ковалентного ее связывания с активированным водонерастворимым носителем.

Однако активность иммобилизованной по этому способу полинуклеотидфосфорилазы низкая и, кроме того, она не обладает необходимыми свойствами.

Для достижения указанной цели в качестве носителя используют силикагель, несущий активные остатки альдегида, присоединенные к носителю по связи кремний-углерод. Для стабилизации иммобилизованной таким образом полинуклеотидфосфорилазы ее обрабатывают восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия в боратном буфере. Предварительно высокоочищенная иммобилизованная полинуклеотидфосфорилаза сохраняет

57 — 68о/о своей первоначальной активности, а ее использование в проточном колоночном варианте позволяет получить полинуклеотиды, не загрязненные примесями эндогенных нуклеиновых кислот.

Пример. 700 мг широкопористого микросферического силикагеля марки силохром

С-1, содержащего 34 мк экв/г активных остатков пропионового альдепида, заливают

0,1 М боратным буфером и подвергают тщательной дезаэрации под вакуумом. После это5 го силикагель загружают в колонку (5 К 0,6 см) и промывают боратным буфером. 4,5 мл раствора полинуклеотидфосфорилазы в боратном буфере (всего 69 мг белка) многократно пропускают через колонку

10 с силикагелем в течение 1,5 час при 4 — 6 С до прекращения изменения концентрации белка в растворе. Для удаления с поверхности силикагеля нековалентно связанного белка колонку промывают 0,5 М раствором NaCI

15 в боратном буфере и затем боратным буфером. Образовавшуюся между белком и альдегидными группами силикагеля связь стабилизируют восстановлением, пропустив через колонку 15 мл раствора боргидрида натрия

20 (1 мг/мл) в боратном буфере. После этого снликагель удаляют из колонки, промывают на стеклянном фильтре охлажденным боратным буфером, подвергают дезаэрации под вакуумом и вновь загружают в колонку для ис25 пользования пммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы в реакции полимеризацпи рибонуклеозиддифо" фатов.

Количество белка, ковалентно связавшегося с силикагелем, рассчитывают по балансу

30 между исходным и несвязавшимся белком, 498315 рывного использования в реакции полимеризации (прн рН реакционной смеси 8,0) составляет 25 суток.

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы путем ковалентного ее связывания с активированным водонерастворимым носителем, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения активности иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы и придания ей необходимых технологических свойств, в качестве носителя используют силикагель, несущий активные остатки альдегида, присоединенные к носителю по связи кремний-углерод.

2, Способ по п. 2, отличаю щи и ся тем, что, с целью стабилизации иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы, ее обрабатывают восстанавливьпощим агентом, например боргидридом натрия в боратном буфере.

Составитель С, Беляев

Техред 3. Тараненко

Корректор Л. Денискина

Редактор Е. Меньшова

Заказ 4!7/!3 Изд. У 178

ЦНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и

Москва, )К-35, Раушская

Типография, пр. Сапунова, 2 определенным по методу Лоури. Для определения активности инкубируют прн 37 С 1 мл реакционной смеси, содержащей в мк-моль:

АДФ 25; трис 100; Mg (CHзСОО) 2 10 (pH

8,0) и водорастворимую или иммобилизованную полинуклеотидфосфорилазу. За единицу активности принимают такое количество фермента в препарате, которое в вышеуказанных условиях за 10 мин катализирует превращение 1 мк моль АДФ в полимер. Таким образом, с 1 г силикагеля связывается ковалентно

41 — 51 мг белка (1,2 — 1,5 мг белка на мк-экв. альдегидных групп), содержащего бб—

120 единиц активности (1,9 — 3,5 единиц активности на мк.экв альдегидных групп). Иммобилизованная полинуклеотидфосфорилаза полностью сохраняет активность в течение месяца при 4 — б C. Период «полужизни» иммобилизованного фермента в процессе непреТираж 576 Подписное

Совета Министров СССР открытий наб., д. 4/5