Способ получения водонерастворимого ферментного препарата
00 499813
ОПИСАНИ :
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
Сова Советских
Социалистических
Республик (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл С 07С 7/00 (22) Заявлено 20.07.73 (21) 1951714/28-13 (23) Приоритет — (32) 22.07.72 (31) 34411/72 (33) Великобритания
Опубликовано 15.01,76. Бюллетень № 2
Государственный комитет
Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) Дата опубликования описания 03,06.76 (72) Авторы изобретения
Иностра,нцы
Томас Андриан Савидж, Лосон Вильям Пауэлл и Кеннет Брайэн Варрен (Великобритания) (71) Заявитель
Иностранная фирма
«Бичем Груп Лимитед» (Великобритания) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТВОРИМОГО
ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА
Изобретение относится к области микробиологии, в частности к получению ферментных препаратов повышенной активности из пенициллинов, Водонерастворимые ферментные препараты получают из фермента пенициллин-ацилазы; водонерастворимого абсорбирую..цего материала, предпочтительно из структурированного полиакрилата, содержащего свободные карбоксильные группы; водорастворимого диальдегида, например глутарового; алифатического диамина, предпочтительно а, м-диаминоалкана с 2 — 10 углеродными атомами. Указанные ферментные препараты обладают pовышенной активностью при получении 6-аминопенициллиновой кислоты.
Известен способ получения водонерастворимого ферментного препарата путем смешения в водном растворе водонерастворимого абсорбирующего материала с пенициллин-ацилазой и диальдегидом, отделения твердого осадка и его промывки. Однако в известном способе выделение фермента из реакционной смеси затруднено: Способ не обеспечивает также высокого выхода 6-аминопенициллиновой кислоты и имеет невысокую степень повторного использования ферментного препарата при последующих (периодических) реакциях получения этой кислоты.
Для повышения стабильности и эффектив5 ности действия препарата предлагается абсорбирующий материал, пенициллин-ацилазу и диальдегид дополнительно смешивать с алифатическим диамином, предпочтительно а, вдиаминоалканом с 2 — 10 атомами углерода.
10 Абсорбирующий материал смешивают с ферментом ацилазой, а затем к смеси последовательно добавляют диальдегид и диамин; абсорбирующий материал смешивают с ферментом ацилазой и диамином, а затем к смеси
15 добавляют диальдегид; абсорбирующий материал смешивают с диамином и диальдегидом, а затем к смеси добавляют пенициллин-ацил азу.
Каждое из веществ, диамин и диальдегид, 20 добавляют в количестве 0,01 — 20 ммоль/г абсорбирующего материала в молярном соотношении диамина и диальдегида от 1: 0,1 до 1:
: 40, предпочтительно в интервале от 1: 1 до
1: 10. При этом диамин добавля.от в количе25 стве 0,1 — 5,0, предпочтительно 0,2 — 2 ммоль/г абсорбирующего материала. Диальдегид до499813
15 бавляют в количестве 0,1 — 10, предпочтительно 2,5 — 5,0 ммоль/г абсорбирующего материала.
Способ осуществляют следующим образом.
Фермент ацилазу получают предпочтительно от бактерий, например штаммов Эшерихиа коли, для использования при расщеплении бензилпенициллина до 6-аминопенициллиновой кислоты или, например, из грибков и акцитомицетов для расщепления феноксиметилпенициллина. Предпочтительным водорастворимым диальдегидом являются глиоксаль или глутаровый альдегид.
В качестве абсорбирующего материала используют порошкообразную целлюлозу и ее производные, ионообменные смолы, силикагель и другие полимерные материалы. Предпочтительно использовать структурированные полиакрилатные или полиметакрилатные смолы, например, в макросетчатой форме, то есть 20 при высоком соотношении удельной поверхности к весу.
В качестве водонерастворимого адсорбента применяют тонкоизмельченный полимерный материал с достаточной поверхностью для по- 25 лучения водонерастворимых ферментных препаратов высокой удельной активности, при этом поверхность возрастает по мере уменьшения размеров частиц абсорбенга. В случае стоуктурированных поли-(мет)-акрилатов ча- 30 стицы смолы могут иметь средний размер
0,6 мм, а удельная поверхность смолы достигает 450 м- /г. По мере уменьшения размеров частиц повышается эффективность реакции сочетания, а также удельная активность целе- 35 вого водонерастворимого ферментного препарата. Из алифатических аминов предпочтительно использовать а,а-алифатический диамин с прямой цепью из 2 — 10 углеродных атомов, например 1,3-диаминопропан или 1,6- 40 диаминогексан.
Ферментный препарат получают в водном растворе при рН 5 — 9. Водонерастворимый абсорбент сначала контактирует с ацилазой в присутствии диамина, а затем — противоточно 45 с диальдегидом и алифатическим диамином.
В этом случае фермент абсорбиру от в присутствии диамина в количестве 0,1 — 5, предпочтительно 0,2 — 2 ммоль/г абсорбента, и диальдегида в количестве 0,25 — 10,0, предпочтительно 50
2,5 — 5,0 ммоль/г абсорбирующего материала.
Для исключения реакции избыточного альдегида по окончании реакции копуляции смолу с ферментом промывают раствором метабисульфита натрия, алифатического диамина, 55 мочевины или глицина.
Стабильность фермента — смолы определяют инкубацией водонерастворимых ферментных препаратов, увлажненных буферным раствором при рН 7,8 и 37 С. При отсутствии 60 стабилизирующего действия субстрата или продуктов быстро увеличивается потеря активности фермента.
Ферментные препараты более ьысокой стабильности получают путем предварительной 65 обработки абсорбента смесью диамина и диальдегида с последующей абсорбцией фермента ацилазы. При этом диамин и диальдегид используют в количестве 0,01 — 20, предпочтительно 0,1 — 10 ммоль/г абсорбента, а молярное соотношение диамина и альдегида должно быть от 1: 0,1 до 1: 40, предпочтительно от 1:1 до 1:10, при рН4 — 9.
При оптимальных условиях стабильность ферментного препарата достаточна для проведения 50 или более последовательных расщеплений пенициллина.
Активность фермента после абсорбции на субстрате повышается, например, при использовании в качестве последнего структурированной поли-(мет)-акрилатной смолы, если фермент предварительно обрабатывают моноили диальдегидом, например формальдегидом .или глутаровым альдегидом при концентрации 0,5 — 5 /о и рН 5 — 8 в течение 2 — 24 ч в случае формальдегида и при концентрации
0,01 — 0,5 /о и рН 5 — 8 в течение 2 — 24 ч в случае глутарового альдегида. Такую обработку проводят до или после выделения фермента из его природного источника, например из целых клеток Е. коли.
Чистота фермента (препарата) колеблется от 0,15 до 50 ммоль/мин/мг протеина и обычно лежит в интервале 1,5 — 15 ммоль/мин/Mr протеина.
Эффективность реакции копуляции и удельная активность водонерастворимого ферментного препарата повышаются при повышении степени чистоты используемого при реакции копуляции фермента. Температура реакций копуляции колеблется от 1 до 37 С, предпочтительно 15 — 25 С.
Возможна также обработка бензилпенициллина или феноксиметилпенициллина водонерастворимым ферментным препаратом в водной среде с рН 6,0 — 9,0, предпочтительно 7,0—
8,5, для получения 6-аминопенициллиновой кислоты. При этом рН влажной смеси поддерживают периодическим или непрерывным добавлением щелочи (так как в процессе дезацилирования от пенициллина отрывается боковая цепь) в емкости с мешалкой или в реакторе типа колонки.
Используемая смола амберлит ХАД-7 представляет собой структурированный полиметакрилат в макрорешетчатой форме.
Частично очищенный препарат фермента ацилазы получают выделением фермента из клеток ацил азы продуцирующего штамма
Е. коли Ко С1В8743 механическим путем в гомогенизаторе. Обломки клеток удаляют фильтрацией после доведения рН до 50. Фермент осаждают общепринятым способом, например сульфатом аммония, насыщением до 75О/о сбором осадка, повторным растворением в воде, диализом раствора, используемого непосредственно для копуляции с водонерастворимым абсорбентом, либо подвергают сублимации (сушке вымораживанием), а затем растворению по мере необходимости.
499813
Таблица 1
Активность
Диамин формулы
H N (СН,) н (н-количество) Количество ацилазы
Количество последующих дезацилирований
Конверсия, Количепрепарата, мкм/мин/г ство, r
15
200
15 г
11 мл
10,2 мл
14 г
13 г
18,7 г
22,2 г
16
24
17,2
12,8
15,2
3
4
8
90
100
10
100
Таблица 2
Применение для дезацилирования
Активность препарата, мкм/мин/г
Количество
15 диамина, М конверсия, О количество, г
106
17,4
17,2
Пример 1. Некоторое количество диамина растворяют в 1500 мл 0,5 М цитратно-фосфатного буфера при рН 5,0. Далее доводят рН до 5,0, вносят заданное количество пенициллин-ацилазы и 100 r амберлита ХАД-7, перемешивают в течение 18 ч при комнатной температуре. Затем приливают 100 мл 50%ного водного раствора глутарового альдегида и доводят рН до 5 О. После дополнительного перемешивания в течение 18 ч твердое вещество отфильтровывают, промывают чодой, Пример 2. Способ осуществляют, как в примере 1, используя 300 мл буферного раствора и 50 мл фермента амилазы в 250 мл воды при перемешивании фермента и смолы в течение 18 ч до добавления 200 мл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида. Активность препарата 20,6 мкм/мин/г.
При использовании 103 r указанного вещества для дезацилирования бензилпенициллина (как в примере 1) 91% пенициллина конверсируется в 6-аминопенициллиновую кислоту в течение 6 ч после 18 последовательных повторных использований вещества.
Пример 3. Заданное количество 1,3-диаминопропана растворяют в 1500 мл 0,25 Vl фосфатного буфера при рН 7,0. При рН 7,0 вносят 25 мл раствора пенициллин ацилазы и 100 г амберлита ХАД-7, перемешивают в течение 18 ч, добавляют 200 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида, доводят рН до
7,0 и перемешивают еще 18 ч. Затем фильтруют, промывают, как в примере 1, и получают препарат установленной активности.
При использовании указанного вещества для дезацилирования 1 л 6% ного бензилпенициллин-калия при рН 7,8 и 37 С получают конверсию после 5 ч при десяти последовательных экспериментах.
Результаты дезацилирования приведены в табл. 2.
П р им ер 4. В 300 мл 05 М фосфатного буфера при рН 7,0 вводят 60 мл раствора пенициллин-ацилазы, затем 240 мл дистиллированной воды и 100 г амберлита ХАД-7. Фер5% -ным раствором метабисуль взята натрия, 1 M раствором хлористого натрия и 0,5 М фосфатным буфером при рН 7,8. Далее определяют активность препарата. Некоторое ко5 личество полученных препаратов используют для проведения ряда последовательных дез;,— цилирований бензилпенициллина калия—
6% в литровом реакторе с мешалкой при рН 7,8 и 37 С. Выход конверсии в каждом экс10 перименте определяют через 5 ч.
Результаты опытов приведены в табл. 1.
Применение для дезацилирования мент абсорбируют на см )ле в течение 18 ч при перемешивании.
25 Затем вносят 11 мл 1,3-диаминопропана и
200 мл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида так, чтобы поддерживать рН 8,0.
Далее раствор доводят до рН 7,0, перемешивают еще 18 ч, фильтруют и твердое вещест30 во промывают, как в примере 1.
Получают 107 г нерастворимого фермента с активностью, установленной на оензилпеннциллин-калий и равной 11,92 мкм/мин/г.
Пример 5. В 500 мл раствора пеницил35 лин-ацилазы, приготовленного на 0,2 M фосфатном буфере при рН 7,0, вносят 100 г амберлита ХАД-7. Смесь перемешивают в течение 16 ч. Твердое вещество отфильтровывают, вносят в 500 мл 5%-ного раствора глутарово40 го альдегида в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,0 и перемешивают еще 16 ч.
Твердое вещество снова отфильтровывают, вносят в 500 мл 0,2%-ного раствора 1,3-диаминопропана в 0,1 М фосфатном буфере при
45 рН 7,0 и перемешивают еще 16 ч. Отфильтро499813
Таблица 4
Потеря активности после хранения при 37 С,;,, рН предварительной обработки 1,3-диаминопропаном и глутаровым альдегидом
Активность
ХАД-7, мкм/мин/г время, дни
37
26
1
Таблица 5
Таблица 3
Диаминпропан, объем/ объем, %
Глутаровый альдегид, объем/объем, О
Активность через
8 дней, мкм/мин/г
Активность, мкм/мин/г
Потеря активности при хранении при 37 - С, у рН реакции копуляции
Удельная активность фермента— — смолы время, дни
5 45
10
41
46
34
29
29
38
41,5
38
39
33
31
26
33
31 50
26
4,5
5,5
6,5
7,5
8,5
22
19
12
11
7 вывают твердое вещество, промывают 5%-ным водным раствором хлористого натрия, 2,5% -ным раствором метабисульфита натрия и 0,2 М фосфатным буфером при рН 7,0. Активность препарата 30,8 мкм/мин/г.
Пример 6. В 600 мл воды вносят 100 r амберлита ХАД-7 и 200 мл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида, рН доводят до 7,0 и перемешивают в течение 2 ч. Далее приливают 2 мл 1,3-диаминопропана и перемешивают еще 18 ч. Твердое вещесгво отфильтровывают, промывают водой и суспендируют в 575 мл 0,2 М фосфатного буфера при рН 7,0.
Затем приливают 25 мл раствора пенициллинацилазы и перемешивают еще 18 ч. Твердое отфильтрованное вещество промывают 1 М раствором хлористого натрия и 0 2 М фосфатным буфером при рН 7,8. Активность препарата 42 мкм/мин/г.
120 г препарата используют для дезацилирования 1 л 8%-ного раствора бепзилпенициллин-калия при рН 7,8 и 37 С; при этом за 5 ч при шести последовательных экспериментах конверсируется больше 80% субстрата.
Пример 7. К 1 мл диаминопропана и
4 мл 25% -ного (объем/объем) глутарового альдегида в 0,2 М при рН 4,5 — 8,5 добавляют раствор фермента (77 MKM/мин/г) и 20 г структурированной полиметакрилатной смолы — амберлита ХАД-7.
Доводят объем до 100 мл, перемешивают его в течение 16 ч при комнатной температуре, отфильтровывают смолу и тщательно промывают фосфатным буфером при рН 7,8.
Удельную активность смолы определяют сразу же и после хранения последней при 37 С в течение 1,4 и 5 дней.
Результаты испытаний приведены в табл. 3.
Пример 8. В 0,2 М фосфатный буферный раствор вносят 16 мл 25%-ного расгвора глутарового альдегида и 1 мл диаминопропана при рН 5 — 9, доводят объем до 100 мл, вносят
25 r амберлита ХАД-7, перемешивают в течение 16 ч при 25 С и промывают буферным раствором при рН 6,0.
Смолу переносят в раствор фермента в
0,2 М фосфатном буферном растворе при рН
6,0, перемешивают в течение 16 ч при 25 С, отфильтровывают и промывают 0,2 Л буферным раствором при рН 7,8.
Удельную активность смолы определяют после хранения во влажном виде (рН буфера 7,8) при 37 С в течение 1,4 и 8 дней.
Результаты испытаний приведены в табл. 4, Пример 9. В 0,2 М фосфатный раствор вносят некоторое количество 25%-ного водного раствора глутарового альдегида и диаминопропана; рН доводят до 6,0, а объем до
100 мл. Далее вносят 25 г амберлита ХАД-7 н перемешивают в течение 16 ч при 25 С. Смолу отфильтровывают, промывают 0,2 М буфером при рН 6,0, после чего смолу вносят в раствор амилазы в 0,2 М фосфатном буферном растворе при рН 6,0, перемешивают в течение 16 ч при 25 С, отфильтровывают, промывают 0,2 М буферным раствором при рН 7,8.
Смолу испытывают сразу же и через восемь дней после хранения во влажном состоянии при 37 С.
Результаты испытаний приведены в табл. 5.
П р им ер 10. В 200 мл 0,2 М фосфатного буфера при рН 6,0 вносят 48 мл 25% -ного водного раствора глутарового альдегида и
3 мл 1,3-диаминопропана, доводя" рН до 6,0, а объем до 300 мл фосфатным буфером. Вносят 100 г амберлита ХАД-7, перемешивают в течение 16 ч при рН 6,0 и 25 С. Смолу отфильтровывают и промывают буферным раствором.
Далее готовят ферментный раствор в буферном растворе при рН 6,0 и обрабатывают
1%-ным формальдегндом в течение 12 ч при
25 C. В раствор фермента вносят предварительно обработанную смолу, перемешивают в
499813
Т аблиц а 6
Заданная (активность ед. фермента — смолы
Удельная активность фермента †смо
Копулирующее действие, у
41,5
30,0
32
77
Т а блица 7
Удельная активность фермента (протеииа), мкм/мин/мг
Удельная активность фермента — смолы, мкм/мин/г
Эффективность копуляции, 3,8
6,1
13,8
31
52
Составитель А. Бражиикова
Редактор Н. Корчеико Техред Т. Курилко Корректор О. Тюрина
Заказ 1121/16 Изд. № 1033 Тираж 575 Подписное
ДНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Рзушская изб., д. 4/5
Сапунова, 2
Типография, пр. течение 16 ч при рН 6,0 и 25" С, затем фермент — смолу отфильтровывают и промывают буферным раствором.
Данные об удельной активности смолы и эффектиьности копуляции при различной концентрации фермента приведены в табл. 6.
Затем используют фермент различной степени чистоты, при этом активность равна
77 мкм/мин/г смолы.
Результаты испытаний приведены в табл. 7.
Пример 11. Способ осуществляют сначала, как в примере 10, но берут смолу амберлит ХАД-7 с частицами меньшего размера (200 и 400 меш) при двух различных концентрациях фермента.
При заданной активности смолы 115—
154 мкм/мин/г удельная актизность фермента смолы 99 — 135 мкм/мин/г при эффективности копуляции 86 — 88%.
Пример 12. Способ осуществляют, как в примере 10, используя 5 кг амберлита
ХАД-7; другие ингредиенты пропорционально увеличивают. Полученный фермептный препарат с активностью 31 мкм/мин/г используют для расщепления 40 л 65 (об.) %-ного раствора бензилпенициллина.
Средняя эффективность конверсии до 6-аминопенициллиновой кислоты после 6 ч реакции при 50 последовательных использованиях препарата 95%.
Получаемый водонерастворимый фермент по предлагаемому способу по сравнению с известным достаточно стоек и может быть использован при 25 последовательных расщеплениях пенициллина в периодически действующем реакторе без заметного ухудшения эффективности реакции.
Кроме того, водонерастворимый ферментный препарат можно извлекать путем последовательного расщепления пенициллина, а остаточный протеин удалять путем обработки кислотой; свежий фермент может рекопулироваться со смолой, а фермент — смолу можно снова использовать для дальнейшего расщепления пенициллина.
Формула изобретения
1. Способ получения водонерастворимого ферментного препарата путем смешения в водном растворе водонерастворимого абсорбирующего материала с пенициллин-ацилазой и диальдегидом, отделения твердого осадка и его промывки, отлич ающийс я тем, что, с целью повышения стабильности и эффективности действия препарата, аб "ороирующий материал, пенициллин-ацилазу и диальдегид дополнительно смешивают с алифатическим диамином, предпочтительно а,со-диаминоалканом с 2 — 10 атомами углерода.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что абсорбирующий материал смешивают с ферментом ацилазой, а затем к смеси последовательно добавляют диальдегид и диамин.
3. Спосооб по п. 1, отличающийся тем, что абсорбирующий материал смешивают с ферментом ацилазой и диамином, а затем к смеси добавляют диальдегид:
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что абсорбирующий материал смешивают с диамином и диальдегидом, а затем к смеси добавляют пенициллин-ацилазу.
5. Способ по пп. 1 — 4, отличающийся тем, что каждое из веществ, диамин и диальдегид, добавляют в количестве 0,01—
20 ммоль/г абсорбирующего материала в малярном соотношении диамина и диальдегида от 1: 0,1 до 1: 40, предпочтительно в интервалеот1:1до1:10.
6. Способ поп.4, отличающийся тем, что диамин добавляют в KO,ëè÷å"тве 0,1 — 5,0, предпочтительно 0,2 — 2 ммоль/г абсорбирующего материала.
7. Способ по пп. 4 и 5, отличающийся тем, что диальдегид добавляют в количестве
0,1 — 10, предпочтительно 2,5 — 5 ммоль/г абсорбирующего материала.
