Способ выделения пектолитических ферментов

 

! С РС4.Ю. т;;, ОПИСАНИЕ"

ИЗОБРЕТЕНИЯ

7; с от

00 480721

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 25.07.73 (21) 1950392/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 15.08.75. Бюллетень № 30

Дата опубликования описания 26,01.76 (51) М. Кл. С 07g 7/02

Го суда р стве ни ы и к ом ит ет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения

Л. И. Орещенко, Л. И. Голгер, К. А. Калунянц, Э. М. Трефилов и Н. Г. Гаевая (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве пектолитических ферментных препаратов.

Известны способы выделения пектолитических ферментов, заключающиеся в том, что экстракты из поверхностной культуры или культуральную жидкость концентрируют в вакуум-вы|парных аппаратах, и из концентрата ферменты осаждают органическими растворителями, таннином и высаливаются нейтральными солями. Однако в известных способах значительны потери ферментов в процессе их выделения.

Процесс концентрирования культуральной жидкости или экстрактов сопровождается потерями ферментативной активности до 20% при концентрировании в 5 — 6 раз, а при концентрировании в 10 раз .потери значительно возрастают. Кроме этого невозможно получение препаратов с высокой степенью очистки.

В упаренном концентрате полностью остаются все балластные вещества (инертный белок, сахара, аминокислоты, соли, пигменты и др.).

Для процесса выделения требуется сложная аппаратура. Процесс длителен во времени и сопровождается значительным расходом пара, воды и электроэнергии.

С целью повышения выхода и активности ферментов концентрирование культуральной жидкости осуществляют ультрафильтрацпей на мембранах, при этом перед ультрафильтрацией рН культуральной жидкости устанавливают 3,8 — 4,0. Ультрафильтрацию осуществляют на мембранах из диацетата целлюлозы с величиной пор от 40 до 60А.

Способ выделения пектолитических ферментных препаратов осуществляют следующим образом.

10 Культуральная жидкость после фильтрации и сепарирования подщелачивается аммиаком до рН 3,8 — 4,0 и концентрируется путем пропускания через мембраны из диацетата целлюлозы с величиной пор от 40 до 60А, при этом отделяются низкомолекулярные вещества (до мол. вес. 25000) и вода от концентрата, содержащего более высокомолекулярные вещества. Потери ферментативной активности пе превышают 6%.

20 Для осаждения пектолитпческих ферментов из концентратов, полученных методом ультрафильтрации, необходимо скорректировать рН до 4,8 — 5,3.

Осажденный одним из органических раство25 рителей, например этанолом, ферментпый препарат высушивается общепринятыми методами. Активность препарата 20000 ед/г, тогда как препараты, .получаемые по существующей технологии, имеют активность 5000—

30 8000 ед/г.

480721

Таблица

Активность пектиназы

Объем, Степень очистки, кратность

Наименование всего единиц ед/мл мл

51,0

629,8

2100

1300

100

2,8

58800

12,3

409

Культуральная жидкость

Концентрат

Очищенный препарат-

51,0

890

28000

90780

96

2000

110

3,2

17,4

549

Культуральная жидкость

Концентрат

Очищенный препарат

48,5

1340

21500

105487

94

2500

4,9

9,7

443

Культуральная жидкость

Концентрат

Очищенный препарат

": Вес дается в граммах.

Составитель И. Гаевая

Редактор Г. Мозжечкова

Техред Т. Миронова Корерктор О. Тюрина

Заказ 3378 8 Изд. Хв 1669 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изооретеипй и открытий

113035, Москва, K-35, Раушская иаб., д. 4i5

Типография, пр. Сапунова, 2

П р и м ер. Культура плесневого гриба

Aspergillus owamori 16 выращивается на питательной среде следующего состава, % . сульфат аммония — 0,7, однозамещенный фосфат калия — 0,1, сернокислый магний—

0,05, 3,5% -ный экстракт свекловичного жома — 95 мл на 100 мл питательной среды и

10%-ная вытяжка солодовых ростков — 5 мл на 100 мл питательной среды. Длительность роста — 3-е суток, активность культуральной жидкости — 50 ед/мл., содержание сухих веществ — 2,5, рН 3,0 — 3,3. После отделения мицелия гриба в фильтрат культуральной жидкости, предварительно отсепарированной, Таким образом, предлагаемый способ получения пектолитических ферментов позволяет снизить потери ферментативной активности в

3 — 4 раза и повысить активность препаратов с 5000 ед/г до 20000 ед/г; степень очистки препаратов повышается в 3 — 4 и более раз.

Значительно снижаются энергозатраты, а также расход органических растворителей, например этанола, в 2 и более раз на осаждение. Длительность процесса сушки сокращается в 2,2 — 1,3 раза.

Предмет изобретения

1. Способ выделения пектолитических ферментов путем концентрирования культуральдобавляется раствор аммиака для доведения рН до 3,8 — 4,0, и производится ультрафильтрация на мембранах из диацетата целлюлозы с размером пор от 40 до 60А. В результате происходит концентрирование в 10, 20, 30 и более раз. В процессе ультрафильтрации происходит очистка за счет удаления низкомолекулярных веществ. рН полученного концентрата корректируется раствором аммиака до

4,8 — 5,3. Фермент осаждается при добавлении этанола до концентрации 75, Осадок отделяется путем центрифугирования и высушивается. Результаты опытов приведены в таблице. ной жидкости с последующим осаждением ферментов органическим растворителем, например, этиловым спиртом, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью повышения выхода и активности ферментов, концентрирование

20 культур аль ной жидкости осуществляют ультрафильтрацией на мембранах, при этом перед ультрафильтрацией рН культуральной жидкости устанавливают 3,8 — 4,0.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, 25 что ультрафильтрацию осуществляют на мембранах из диацетата целлюлозы с величиной пор от 40 до 60А.

Приоритет по пункту 2 установлен от

13.9.74 г.