Завод медицинских препаратов при Ленинградском ордена Ленина производственном объединении мясной промышленности (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ L-АМИЛАЗЫ

ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Изобретение относится к производству ферментов, а именно к способам выделения из поджелудочной железы L-амилазы и ее очистки.

Известен способ выделения 1-амилазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота с последующей очисткой. Он заключается в том, что измельченную и обезвоженную железу обрабатывают раствором, содержащим ионы Са, в полученный раствор добавляют ацетон и осадок отделяют центрифугированием. Затем осадок суспендируют в минимальном количестве воды и диализуют против проточной воды.

Отдиализованный раствор осветляют путем центрифугирования и проводят кристаллизацию.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение чистоты 1-амилазы за счет того, что диализ раствора осуществляют против фосфатного буфера, полученный диализат дополнительно обессоливают на анионите в рН-форме в статических условиях, а затем обрабатывают кизельгуром.

Кизельгур удаляют фильтрацией, а полученный раствор лиофильно высушивают.

Из растворов, содержащих ионы Са++, для обработки поджелудочной железы используют ацетат кальция, расходуя его при соотношении 1: 3 к весу поджелудочной железы.

Пример. Мороженую свиную панкреазу измельчают на волчке с диаметром отверстий решетки 2 мм. Измельченную железу порциями загружают в емкость с охлажденным аце5 тоном в соотношении 1: 5.

Операции обез>киривания и обезвоживания ведут при нулевой температуре в течение шести часов, осуществляя каждый час перемешивание по 15 мин. Осадок выдерживают

)О 3 вЂ” 4 ч, после чего сифонируют ацетон. Железу заливают новой порцией ацетона в соотношении 1: 3. Такую обработку повторяют трижды.

Обезжиренную железу отпрессовывают на

15 гидравлическом прессе и сушат тонким слоем под вакуумом при 18 вЂ” 20 С. Высушенную железу измельчают на шаровой мельнице. В итоге получают 25 г сухой панкреазы. Затем следует непосредственное выделение L-амила20 зы и ее очистка. Для этого полученные 25 г сухой железы экстрагируют 0,02 Н раствором ацетата кальция в соотношении 1: 10 в течение 16 ч при температуре от 0 до 3 С.

Остаток отделяют фильтрованием и суспенди25 руют в 0,02 и. растворе ацстата кальция (в соотношении 1: 3 к весу сырья) и подвергают повторной экстракции в течение 2 ч при

3 С. Полученный экстракт фильтруют. остаток отпрессовывают на гидравлическом прес30 се, 506595

Составитель М. Андреева

Редактор Л. Василькова Техред Т. Писакина

Корректор М. Лейзерман

Заказ 1090/9 Изд. М 1208 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Экстракты объединяют и фильтруют через сукно при 3 С. Из полученного фильтрата осаждают балластные белки, охлаждают ацетоном, конечная концентрация которого равна

47 /о. После отделения балластных веществ доводят концентрацию ацетона до 69%. Выпавший осадок, содержащий амилазу, отделяют на центрифуге при 0 С и промывают 90%ным спиртом, удаляя ацетон. Осадок амилазы растворяют в воде при соотношении 1: 2, доводя рН до 8,0 путем добавления 0,01 н раствора едкого натрия, а затем диализуют против фосфатного буфера в течение 8 ч при

4 вЂ” 5 С.

Диализат отделяют от выпавшего осадка и обессоливают на анионите ЭДЭ-10П в ОНформе в статических условиях при концентрации смолы 10 г/л. После отделения смолы фильтрацией под вакуумом раствор обрабатывают кизельгуром из расчета 8 г/л. Затем кизельгур отделяют и полученный прозрачный раствор амилазы фильтруют на асбесто-целлюлозных фильтрах. Отфильтрованный раствор замораживают при вЂ” 60 С и лиофильно высушивают при конечной температуре в продукте +25 С. В результате получают 350вЂ”

400 r сухого препарата с активностью 5вЂ”

7 тыс. ед/кг. При хранении в комнатных условиях в течение 3 лет он практически не теряет активности. Такой препарат амилазы может найти применение не только для проведения научно-исследовательских работ, но

5 и для медицинских целей.

Формула изобретения

1. Способ выделения и очистки 1 -амилазы из поджелудочной железы, предусматриваю10 щий экстракцию измельченной и обезвоженной поджелудочной железы раствором, содержащим ионы Са, осаждение ее из экстракта, например, ацетоном, отделение полученного осадка, растворение его с последующим

15 диализом раствора, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты L-амилазы, диализ осуществляют против фосфатного буфера, полученный диализат дополнительно обессоливают на анионите в рН-форме в стати20 ческих условиях, а затем обрабатывают кизельгуром, удаляют последний, например, фильтрацией и полученный раствор лиофильно высушивают.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, 25 что из растворов, содержащих ионы Са, используют ацетат кальция, при этом его вводят при соотношении 1: 3 к весу поджелудочной железы.