Носитель ферментов для процесса разложения нуклеиновых кислот и их солей

 

О П И С А Н И Е (ii) 45574I

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Реслублик (61) Зависимый от авт. свидетельства (22) Заявлено 12.03.73 (21) 1895310, 23-4 с присоединением заявки № (32) Приоритет

Опубликовано 05.01.75. Бюллетень № 1

Дата опубликования описания 26.02.75 (51) M. Кл. В 01j 11/00

Государственный комитет

Совета Мнннстров СССР (53) УДК 660973 (088.8} ло делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения В. П. Варламов, Д.-Г. А. Вальковский, С. В. Рогожин, В. Я. Мокеев и 1О. В. Чурсанов

Институт элементоорганических соединений АН СССР

t !

1 (71) 3 аявитель (54) НОСИТЕЛЬ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ПРОЦЕССА РАЗЛОЖЕНИ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ СОЛЕЙ

Изобретение относится к ферментной технологии с использованием фиксированных на носителе ферментов, ковалентно связанных с неорганическим носителем.

Известен неорганический носитель †диатомит, который используется для присоединения ферментов, необходимых для процесса разложения нуклеиновых кислот и их солей.

Недостатками известного носителя являются: его малая емкость (концентрация активных групп — 0,05 ммоль/г), значительные примеси окислов металлов (до 10%) и существенное снижение ферментативной активности в течение месяца непрерывной работы (до

25% от исходной) .

Цель изобретения — повышение содержания фермента на 1 г носителя, длительное сохранение его ферментативной активности при непрерывной работе (по крайней мере в течение одного месяца), а также повышение устойчивости к температурному воздействию и к влиянию рН среды.

Указанная цель достигается тем, что в качестве носителя ферментов применяют макропористый кремнезем.

Пример 1. Макропористый кремнезем—

«Силохром» кипятят в 0,1 — 10%-ном растворе у-аминопропилтриэтоксисилана в среде органического растворителя в течение 30 час. Получают аминированное производное «Силохрома» с содержанием аминогрупп 500 микромолей на 1 г носителя.

Аминированное производное «Силохро5 ма» обрабатывают 1% -ным водным раствором глутарового альдегида при температуре

0 — 5 С в течение 0,5 — 2 час и добавляют 0,5—

1,5% -ный раствор фермента экзонуклеазы актиномицетов. Реакционную смесь перемешиlo вают 2 — 12 час при температуре 0 — 5 С. После этого носитель с присоединенным ферментом промывают холодным 0,5 М раствором поваренной соли и ледяноп водой.

Проточную колонну, термостатированную

15 при 37 С, заполняют экзонуклеазой А — 5, присоединенной к носителю «Силохром». На колонну подают 1 — 10 /О-ный раствор нуклеиноных кислот в буфере (рН=9,0) со скоростью

10 — 300 мл/час. При прохождении через ко20 лонну нуклеиновые кислоты разлагаются до

5 -нуклеотидов.

Фермент практически не теряет своей активности в течение месяца непрерывной работы колонны. В водорастворимом состоянии

25 этот фермент может быть использован только однократно (в течение нескольких часов) вследствие потери своей активности.

Пример 2. К 3 r аминированного макропористого кремнезема (полученного по приме30 ру 1) в 200 мл метилового спирта добавляют

455741

Составитель Т. Табасаранская

Техред А. Камышникова

Корректор Н. Аук

Редактор Н. Вирко

Заказ 322/14 Изд. Ке 288 Тираж 782 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/8

Типография, пр, Сапунова, 2

1,5 r n-нитробензойной кислоты и 1 r N,N -дициклогексилкарбодиимида. После перемешивания в течение 20 час производное промывают метанолом, добавляют 1 г дитионита натрия Xa>S O4 в 10 /о-ном водном растворе пиридина и перемешивают 1 — 5 час при 50—

90 С.

К полученному соединению приливают

10 мл 2,5 н. раствора НС1 и 5 мл 7 -ного водного раствора нитрита натрия NANO>. Образовавшееся диазопроизводное перемешивают с

0,1 — 1 /о-ным раствором щелочной фосфатазы в 0,1 М фосфатном буфере (pH=8,1) в течение 4 — 20 час при температуре 0 — 5 С.

Фермент, присоединенный к носителю, загружают в сосуд с мешалкой термостатированный при 25 С. Затем добавляют анализируемые олигонуклеотиды, в которых под действием фермента происходит отщепленис концевого неорганического фосфата. (Ри„р,.) . .Периодически отбирают пробы для определения

Риеорг и вычисляют количество концевых фосБ фатных групп в анализируемом материале.

Такой анализатор концевых фосфатных групп сохранял свою активность в течение месяца работы.

В качестве ферментов, фиксированных на

10 носителе, были использованы также фосфодиэстераза змеиного яда и 5 -нуклеотидаза яда гремучей змеи.

Предмет изобретения

Применение макропористого кремнезема в качестве носителя ферментов для процесса разложения нуклеиновых кислот и их солей.