Способ получения олигорибонуклеотидов

 

i>) 458555 блы на,е, ИЗОБРЕТЕ И ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 28.05.73 (21) 1926849, 23-4 с присоединением заявки № (32) Приоритет

Опубликовано 30.01.75. Бюллетень № 4

Дата опубликования описания 18.03,75 (51) М. Кл. С 07d 51, 50

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 547.963.32 (088.8) ло делам изобретений и открытии (72) Авторы изобретения

Т. А. Авдонина, Л. Л. Киселев и Н. В. Гнучев

Институт молекулярной биологии AH СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к усовершенствованию способа получения олигорибонуклеотидов заданного строения.

Известно специфическое расщепление РНК (рибонуклеиновой кислоты) с помощью гуанил-РНК-азы Т, по остаткам инозина и 2экзо-N,N-диметиламиногуанозина после предварительной реакции производных гуанозина (Г) и 2-экзо-N-метилгуанозина с глиоксалем.

С целью получения смеси тринуклеотидов

ГфГфАф, ГфГфЦф, ГфГфУф а также этих же тринуклеотидов в индивидуальном состоянии, полирибонуклеотид предварительно обрабатывают кетоксалем.

Способ основывается на устойчивости фосфодиэфирной связи между туаниновыми основаниями, модифицированными кетоксалем, и соседним с 3 стороны нуклеотидом при гидролизе с помощью рибонуклеазы Т>. В результате при действии на любые модифицированные полирибонуклеотиды рибонуклеазой

Т2 образуется фракция тринуклеотидов, которая содержит только смесь ГфГфАф, ГфГфЦф и ГфГфУф. Дальнейшая обработка состоит в снятии модификатора, что достигается простым изменением рН раствора и, в случае необходимости, .разделением смеси трех тринуклеотидов хроматографическим методом на,индивидуальные тринуклеотиды.

Способ позволяет одновременно получать смесь динуклеотидов ГфУф, ГфЦф, ГфАф, которая может быть легко разделена на индивидуальные динуклеотиды.

При необходимости способ может использоваться для получения более длинных олигорибонуклеотидов общей формулы (Гф) „Хф, где n)3, Х=аденозин (А), уридин (У), цитидин (Ц) .

Выход продуктов полностью зависит от природы полирибонуклеотида, подвергаемого ферментативному гидролизу (содержания в нем последовательностей ГфГфАф, ГфГфЦф, Гф ГфУф) и составляет 80% от теоретически возможного.

Если гидролизу подвергается сополимер поли- (У, Г) или поли- (А, Г) или поли- (Ц, Г), то во фракции тринуклеотидов будут сразу индивидуальные ГГУ, ГГА и ГГЦ, соответ20 ственно, т. е. отпадает необходимость во втором разделении.

Пример. 2 мг РНК вируса табачной мозаики выдерживают при 37 С в течение

4 час с 1,3 мл 325 / -ного раствора кетоксаля, 25 0,05 мл раствора какодилата натрия (159,98 г/л) при рН 7, 0,125 мл раствора этилендиаминтетраацетата натрия (37,24 г/л) .

После окончания реакции РНК, освобождают от избытка кетаксаля трехкратным осаждени30 ем из 70%-ного спирта.

458555

Предмет изобретения

Составитель Е. Соколова

Техред О. Гуменюк

Редактор E. Дайч

Корректор О. Тюрина

Заказ 562/10 Изд. № 1078 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Осадок растворяют в 2,5 мл воды, доводят рН раствора уксусной кислотой до 4,5 и добавляют 0,1,мл раствора рибонуклеазы Т>, содержащего 500 единиц активности фермента и выдерживают 2 час при 37 С. Затем растВор наносят на колонку, объемом 2,5 мл, заполненную смолой ДЭАЭ вЂ” сефадекс А — 25.

Смола в колон ке уравновешена буфером

А, содержащим, г/л: 2,42 оксиметиламинометана-трис, 1,23 борной кислоть1, 420 мочевины, рН 7,6.

К колонке подключают раствор из двух последовательно соединенных сосудов, в первом сосуде — буферный раствор А, во втором— буферный раствор Б, содержащий, т/л: 2,42 оксиметиламинометана, 1,23 борной кислоты, 420 мочевины, 15,55 хлористого натрия, рН 7,5.

Скорость протока жидкости через колонку 3 мл/час. С 27 по 33 мл собирают раствор с колонки, содержащий смесь Аф, Цф, Уф и

Г*ф (Г*ф — продукт реакции Гф с кетоксалем). С 66 по 90 мл собирают раствор с колонки, содержащий ГфАф, Уф и ГфЦф.

С 105 по 120 мл собирают раствор, содержащий ГфГфЦф, ГфГфАф и ГфГфУф.

Выход динуклеотидов 0,4 мг, тринуклеотидов 0,15 мг.

В случае необходимости из собранных растворов можно удалить соль пропусканием их через колонку со смолой биогель — Рз или через колонку со смолой ДЭАЭ вЂ” целлюлозой.

15 Способ получения олигорибонуклеотидов общей формулы (Гф)„Хф, где и) 1, Х аденозин (А), уридин (У), цитидин (Ц), обработкой полинуклеотидов рибонуклеазой Тз и последующим разделением по длине цепи из20 вестными приемами, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, полирибонуклеотид предварительно обрабатывают кетоксалем.