Способ получения декапептида в-цепи инсулина человека последовательности 21-30

 

ecyAapi:твенивй кенар

Csee Мннавтра КР ю дювви изобретший

N sYKpbITIN (43) Опубликовано0Ь.07.76.Бюллетень № 25 (Я) УДК 547„964. 4.,07 (0СЯ.8 ) (45) Дата опубликования опиаания09.11.76 (72) Авторы изобретении

М. И, ТБтов, Ж. Д. Беспалова и „ ., (4,, Хйюнтьеъь .

Д лНИНГСаДСКИБ (ЩДЕНа ДЕ««ис" О л«ОПГВ„т«лл ГО\ Д ъ«« «л 1,».. НО«л« вЂ” «Ул л»«л ««Ч

ГОСУДЙРСТВЕНКЬ1й УНБВ ЭРСИТЕТ ИМ, Л,"л.« .лл."»ЦВ.НОВИ (7l) Заявитель

f54) CHQGQE ДОД1/ЧЩНИЯ ДЯ) ллл ) t?-, «)" «Я,, В "«,".«" р т л» «" «" г л;, л л

gp+Qgp ПО(ДЯ Q -;, л 7 f " лл «,.1»1

Изобретение Относится к усоверщенствованию cBGcG6R получения pGKGD éTH @ В. инсулина человека. Это соединение может быть использовано при синтезе как природных Бнсулинов« так и их аналогов» б

Известен спОсОб получения декянептида

В инсулина, заключающийся в том, а .-ъо что известными методами проводят последовательное наращивание пептидной пепи с

Сконца конденсацией соответственно защи- щ щенных ао аминогруппам и карбоксильным группам аминокислот, причем в качестве защиты группы используют тозильную защиту с последующим удалением защитчых групп натрием в жидком аммиаке. Я

Недостатками такого способа являются использование тозильной защиты для блокирования гуанидиногруппы аргинина и E аминогруппы лизина, которая удаляется в 2Î жестких условиях, приводящих к деструкпии молекулы: обработка натрием в жидком аммиаке либо насыщенным раствором бромистого водорода в ледяной уксусной кислоте при 70 С. И а ы „"де лил,б««бл- Ч» ОК««« —...»л«««««««, q g, -:ло «,—„.«л»;.Ьи «-.у анидИНОГИу 2. «» Yi трзт„»»л1 »» ".:" ;7Лл К БкарООНаЩ НОй л, ВИ8 лк "" «ОГ) Х « - »л Ъ" -««- " -л»: С7«- лл" лПЧ ГЕН

ЙБ ЛХ 9 ««Е«СЯ СГ, «С .;: ллОЛ» и Г- .«Ц i«Ð2,,лл««л У«и»»

Да В -"-,ЕПЧ л«ИСУЛИНа ЧЕЛОВЕКИ ПССЛЕДОЯБлЕЛЬ».

НОСТИ 2Х-=-"Г КОБДЕНСБДИЕй ГЕДтеп,"=;.,".Утз,ла Фенилалч«ннл=фрнилаланилтивознл-.т сеонил.=про

QH TD 6«" тилоксихарбокз:,ллнзил.". треоний gpQHБг тре bvYRïcêcÁêûp6cHHëëÁçè Ð ÖçeÎHè на с карбобензоксиглипнном и трикарбобензоксиаргинином или трикаобООензокс"аргн-

НИЛГЛИПБНОМ И C Р лтрЕл«л» 6«г« ри,тл,«лмл„«g+z

РОМ КаобобЕНЗО««С«лГЛУталМИЧОВО@ *,ги:-Ч -,«Ы

ПОСЛЕДУЮЩИМ СЬлЯТ««Е«»л За«»ЦИ««Ь«« ата Д«««рг КИ» л

ГИДРОГЕНОЛИЗОМ И ВЫДЕЛЕНИЕМ П«ЕЛ«ЕВОГС ПРОдукта известным способом.

П g и м е р 1,. КВ» 6Î6ÎÂçcêcÁ-Гллййил фЕНИЛИ«РБНИ Р=.ф«лНИЛаЛБНИЛ ГИРОЗИтлтРЕОБИЛ

Про«нуЛмгрЕТ»б««ТБЛОКСБКрОЯлн««л«,-:щЗЧ р- «лл:л,-лЧИН з 20349

0,37 гкарбобензокси-фенилаланил-фенилаланил-тирозил греонил-пропилгрет.«бутилоксикарбониллизил-треонинарастворяютв 10 мл

5Р г карбобензоксифенилаланил-фенилаланил-тирозил треонил-пролил- грет.-бутилоксикарбониллизиа-треонина растворя1от в 40 мл метанола и гидрируют в присутствии 0,3 г палладия на угле до прекращения выделения углекислого газа. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в 3,95 1 11 н. едкого патра и к полученному раствору при перемешивании добавляют 1,8 r и-нитрофенилового ц эфира карбобензоксиглицина в 30 мл диметилформамида.

Смесь выдерживают три дня при комнат ной температуре, охлаждают до О С и обрабатывают 0,5 н. серной кислотой. Выпавший 11 осадок отфильтровывают, промывают на филь тре водой и сушат. После кристаллизации из смеси метанол-эфир получают 4,7 г (89%) продукта, т.пл. 142-145оС. с - -31о (С 1, ДМФА). 20

Найдено,%: С 60,15; Н 6,79.

Вычислейо,%: С 60,43; Н 6,73.

Трикарбобензокси-аргинил-глицил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил- 25 трет.- 5утилоксикарбониллизил-треонин (продукт П ).

Остаток, полученный после гидрирования (см, предыдущую методику) 1,6 r продукта

1, растворяют в смеси 3 мл диметилформамида и 0,2 мл триэтиламина, к полученному раствору добавляют 1,0 г п-нитрофенилового эфира трикарбобензоксиаргинина в

9 мл диметилформамида. Смесь оставляют на три дня при комнатной температуре, ох- 35 о лаждают до 0 С и разбавлят 0,5 н. серной кислотой. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают водой и сушат. После кристаллизации из смеси метанол-эфир получают 1,8 г (77%) продукта, т. пл. 185- 40

187 С LcL1 24о (с 1, ДМФА).

Найдено, %: С 61,22; Н 6,50.

С85 Н103 513024

Вычислено,%. С 61,58 Н 6 41.

Карбобензокси- т трет.-бутиловый эфир- 45

-глутамил-аргинил-глицилфенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил-трет.-бутилоксикарбониллизил-треонин.

0,77 г продукта I! растворяют в 10 мл метанола, к полученному раствору добавляют 59

0,45 мл 1,0 и. серной кислоты и 0,3 r палладин на угле и гидрируют три дня, Катализатор отфильтровывают, фильтрат разбавляют водой (10 Mn) и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит ИРА-410 (ОН-форма). За- Я тем смолу отфильтровывают, промывают на фильтре водой до отрицательной нингидринной реакции фильтрата, фильтрат упаривают досуха и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора, Остаток растворяют в 5 мл диметилформамида и добавляют 0,3 r и-нитрс:фенилового эфира трет утилового эфира карбобензоксиглутаминовой кислоты. Смесь выдерживают два дня при комнатной температуре, разбавляют абсолютным эфиром, выпавший осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и сушат. После кристаллизации из смеси метанол-эфир получают 0,57 r (80%) продукта, т. пл. 168-170 С. 3

37 (с 1, ДМФА).

Найдено,%: С 58,15; Н 7,08.

Вйчислено,%: С 58,15; Н 7,06.

Аминокислотный состав (в скобках даны теоретические величины): глицин 1,3 (1 ), глутаминовая кислота 1,0 (1), треонин 1,9 (2), лизин и аргинин 2,3 (2), тирозин О,7 (1 ), фенилаланин.

Пример 2. Трикарбобензокси-аргинил-глиц ин.

1,18 г п-нитрофенилового эфира трикарбобензокси-аргинина и 0,25 г глицина с

0,28 r бикарбоната натрия растворяют в смеси 5 мл воды и 10 мл диоксана, полученную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре, разбавляют 2 н. соляной кислотой, выпавшие кристаллы отфильтровывают и промывают на фильтре водой.

После двукратной кристаллизации из этанола получают 0,97 г (91%) продукта, т.пл.

153-156 С. а(j + 7 (с 1, ДМФА), Найдено,%: С 60,58; Н 5,58.

Вйчислено,%: С 60 65 Н 5 56. и-Нитрофениловый эфир трикарбобензокси-аргинил-глицина.

2,3 г трикарбобензокси-аргинил-глицина и 0,6 r п-нитрофенола растворяют в 10 мл тетрагидрофурана, охлаждают до -5оС и добавляют 0,9 г дициклогексилкарбодиимиса.

Полученную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха и остаток кристаллизуют из ацетонитрила. Получают 1,9 г (67%) продукта, т.пл„188-191 С, Га 1 - 2 (с 1, ДМФА).

Найдено, %: С 60,58; Н 5,58.

СЫН

Вычислено,%: С 60,71; Н 5,52, Трикарбобензокси-аргинил-глицил-фенила лани л-фени ла лани п-тир ози и-треон ил-пролил-трет.-бутилоксикарбониплизил-треонин.

520349

Составитель Л. Фонина

Редактор Л. Фонина Техред М. Левицкая Корректор ° М. Русна

Заказ 4335/186 Тираж 576 Подписное

ЦНИИПИ Государсгвенного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 метанола и гидрируют в присутствии 0,1 г палладия на угле. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха и остаток растворяют в 0,30 мл 1,11 н. едкого патра.

К полученному раствору добавляют 0,3 r 5 п-нитрофенилового эфира трикарбобензокси-аргинил-глицина в 5 мл диметилформамида.

Смесь оставляют на два дня при комнатной температуре разбавлиют 0,5 н. серной кислотой, выпавшие кристаллы отфильтровыва- 10 ют, промывают водой и сушат. После кристаллизации из смеси метанол-эфир получают 0,39 г (73%) продукта, т. пл. 183186оС. ГАЗ - 20 (с 1, ДМФА).

Найдено,: С 61,54; Н 5,96. 15

СвзН103, 120и °

Вычислено,Ъ С 61,58; Н 6,41.

Следующую стадию проводят так же, как в примере 1.

Формула изобретения

Способ получения декапептида В-цепи инсулина человека последовательности 2130 конденсацией низшего пептида с защищенными аминокислотами известным способом, удалением защитных групп и выделением целевого продукта известным способом отличающийся тем, что, с целью усовершенствования технологического пропесса, в качестве низшего пептидов используют гептапептид фенилаланил-фенил ланию -тирозил-треонил-пролил-трет;бутилоксикарбониллизил-треонина, который конденсируют с карбобензоксиглипином и трикарбобензоксиаргинином или трикарбобензоксиаргинилглицином, и с g -грет;бутиловым эфиром карбобензоксиглутаминовой кислоты и защитные группы удаляют каталитическим гидрогенолизом.