Способ получения антибиотика сисомицина

 

ОЛ ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ееА е ИКТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 559658

1 (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 26.06.69 (21) 1342825/13 (23) Приоритет — (32) 27.06.68 (51) М. Кл. С 12 0 9/24, Гесударстаекнмк комитет

CoNto NNINefPN CP ае делам иаебретеаий и еткрытий (31) 740742 (33) СЫА (43) Опубликовано 2505.77. Бюллетень № 19 (53} УД1< 615.779.9 (088.8) (45) Дата опубликовайия описания08.12,77 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

М рнЙ.В Вйн, ржм.Л д „щ X В (ОйА) Иностранная фирма. 1мерико Лтд" (в1вейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОП4КА СИСОЫИЦИНА

О э 0

NHCH, (НеМН g

Изобретение относится к области медипины, а именно к производству антибиотиков, Предлагаемый способ получения антибиотика в литературе не omcaa.

Способ получения антибиотика снсомицина общей формулы

ИО О

Н2

16 заключается в том, что ниамм ййй1 3292 Miегоmo-. поарогв 1AQ06ll813 или нттамм, соответствукмций ему в отношении основных микроморфологических и физиологических своиств н способности продуциро. вать иеяевсй продукт, выращивают в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 20 — 40 С и рН

6,8 — 80 и выделяют целевой продукт в свободном виде нли в виде продукта конденсации с альдеги" ом, или в виде гидратов известными приемами.

Полученный аншбиотик оказывает отрицатель. ное влияние на рост грамм положительных и особенно грамм- отрицательных бактерий и может быть также кспольэован в виде различных,функциональных производных.

В1тамм Ийй1. ЗЮ2 выделен кэ образца почвы

Национального леса Инно в Калифорнии. После ипкубацин.штамма в течение 14 суток при 24 — 26 С на агаровой среде, содержащей 3% амина типа А, 10% декстроэы и 1,5% агар — агара, наблюдается рост от удовлетворительного до плохого. Невооруженным глазом ваэдушный ьицелнй установить нельзя.

Иногда появляются несколько хорошо развитых колоний в области инокуляции. На некоторых чашках иаблюдиат слабый красновато — коричневый днффунднрувицнй пигмент, связанный с коловеями. Цвет поверхности колоний от краснокоричневого до темно — коричневого. Методом фазового контраста можно установить, что ущелий является длинным, разветвленным, регулярным и не разделенным поперечными перегородками.

Диаметр мицелия приблизительно 0,5 мкм. Про. стые спороформы имеют по одной споре диаметром

1,0-1,5 мкм.Стенки спор шероховатые от яйцевидной до сферической формы.

559658

Штамм хорошо растет при 28--37 С. При температуре 50 С никакого роста не наблюдается. На среде из глюкозы и аспаргинового агара рост оказывается плохим. Растущая колония штвмма гидролизует желатину, молоко, крахмал и восстанавливает нитрат натрия.

Пример 1. В колбу со 100 мл питательной среды, содержащей, г/л: 8 мясного экстракта, 5 триптона, 5 дрожжевого экстракта, 1 декстроэы, 24 крахмала и 2 карбоната кальция, вносят лиофильно высушенную культуру штамма или кретки, полученные иэ скошенной культуры, и выращивают 5 суток при 35 С на вращаьщемся вибраторе. 25 мл культуральной жидкости, полученной на этой стадии, вносят в колбу с 500 мл питательной среды того же состава и выращивают 3 суток цри 28 С на вращающемся вибраторе.

В сосуц емкостью 14л вносят 500 "m культуральной жидкости, полученной на второй стадии, и

9,5л питательной среды, содержащей 50г/л декстрина, 5 г/л декстрозы, 35 г/л соевой муки, 7 г/л карбоната кальция, 10 моль/л хлористого кобальта и 10 мл пеногасителя. Значение рН среды устанавливают на уровне 8 и осуществляют культивирование в течение 66 — 90 час при перемешивании (250 об/мин) и аэрации (4,5 л/мин при 22,5 атм) .

Полученную культуральную жидкость подкисляют бн. серной кислотой до рН2 и оставляют для дальнейшей обработки.

170 л подкисленной кулыуральной жидкости фильтруют, промывая мицелий водой, и добавляют щавелевую кислоту, осаждают кальциевые соединения, выпавший осадок отфильтровывают, а фильтрат нейтрализуют аммиачной водой и пропускают через колонку с 1500 — 2000 г катионита (амберлит

РС-50) в аммонийной форме. Смолу промывают водой и элюируют 2н раствором аммиака, собирая фракции по 400 мл. Активные фракции объединяют, упаривают в вакууме досуха и получают 28 г сырого антибиотика с активностью 500 мкг/мг.

Для очистки 28 г сырого антибиотика растворяют 100 мл дистиллированной волы и пропускают через колонку с анионитом.

Элюцию производят дистиллированной водой, собирая фракции по 100 мл. Активные фракции лиофильно высушивают и получают 5,7 г антибиотика с активностью 900 мкг/кг.

Для получения сернокислой соли 3,9 r основания антибиотика, полученного как это описано выше, растворяют в 60 мл водь1 и доводят значение рН до 4,5 добавлением 6 н. серной кислоты. Раствор обрабатывают актнвированным углем, фильтруют и осаждают препарат добавлением 1 л метанола.

После фильтрования и высушивачия получают 4,8 г сернокислой соли антибиотика с активностью 640 мкг/кг.

Пример 2. 200 г порошка целлюлозы типа

Уотман Nr I смешивают с 20 мл растворителя хлороформ /метанол/ l7".-ная гидроокнсь аммония (2:1: l) и полаял в колоцки диаметром 6,36 мм

29

Ю

4 и высотой 508 ММ, Растворитель пропускают чере= колонку до появления желтой полосы примесей. 2 сульфата антибиотика растворяют приблизительно в

3 мл растворителя, смешивают с некоторым количеством порошка целлюлозы, высушивают под вакуумом и подают в верх колонки. Пропуская через колонку со скоростью l мл в 1 мин, собирают фракции по 5 мл через каждые 15 мин. Фракции

1 1 — 180 соединяют, выпаривают, вновь растворяют в воде и пропускают через I RA 4 01S анионообменную смолу в гидроксильном виде. Серной кислотой значение рН элюата устанавливают на 4,5, раствор обрабатываю углем, фильтруют и концентрируют, в концентрат добавляют избыток метанола, образовавшийся белый осадок отделяют фильтрованием.

Осадок растворяют в воде, раствор пропускают через колонку иэ смолы типа IRA 401$ в гидроксильной форме. Вытекающий поток собирают, концентрируют, подвергают лиофильной сушке и получают приблизительно 300 мг антибиотика в виде основания с активностью 1000 мкг/мг.

Пример 3. 104,7 r антибиотика в виде основания растворяют в 4 мл воды, хлористоводородной кислотой значение рН раствора устанавливают на 4,5. Раствор выпаривают, остаток растворяют в метаноле. К раствору добавляют избыточное

lt количество ацетона, выпавший осадок отфилыровывают и получают 130 мг гидрохлорида антибиотика активностью 753 мкг/мг.

Пример 4 Приготовление кристаллического моногндрата антибиотика. Готовят хроматографическую колонку иэ геля двуокиси кремния, используя в качестве растворителя смесь иэопропанол /СНС1,/ гидроокись аммония (1:2:1), 1 г антибиотика в виде основания растворяют в

5,0 мл раствори1сля, адсорбируют фракции по

5,0 мл и определяют расположение фракций тонкослойной хроматографией на плитах иэ геля двуокиси кремния. Подходящие фракции (44 — 78) соединяют и выпаривают под вакуумом, при этом получа ют светло — желтую жидкость, которую путем аэеотропной дистилляш и с этанолом кристаллизуют в светло — жел1ые розетты. Полученный продукт представляет собой моногидрат антибиотика.

Т.пл. около 180--185 С; выход 650 мг.

Пример 5. 11олучение продукта конденсации антибиотика с бенэальдегилом.

5,0 r антибиотика в 60 мл абсолютного этанола обрабатывают 5,9 г бензальдегида, репиркулнруют в течение 1 час, Раствор охлаждают и филыруют,получают

7,0 г бе.".orî кристаллического ве ества,, т.пл. 123-126 С, (а), = + 43,2", концентрация 0,3;:! в CHCI э. Элементарный анализ показывает лять бенэальдегидных остатков.

Аналогично замещая бенэальдегидный реагент эквивалентным количеством одного из следующих альлегидов: ацетальдегил, фурфурол, пиклопенталацетальлс ил, кро ональлегнл, салицнлальлегид. валили!, Bc .p;I Грянь, !еI пд, псрнлоксал. Получают cool BcTстн юп!ие иродуK еы конденсации с ильдсгидями.

559658

Составитель С. Малютина

Техред H Лндреячук

Корректор М. немчик

Редактор Л. Бер

Тираж 541 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретения н открыти»

113035, Москва, Ж вЂ” 3S, Раушская наб.д.4/3

Заказ 1430/116

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

Способ получения антибиотика сисомнцина, о тл и ч а ю шийся тем, что штамм культуры 1ч ВВ1 оз

3292 Miегоmonospgra ingoensis или мутант, соответствующий ему в отношении основных микроморфологических и физиологических свойств н способности продуцировать целевой продукт, выращивают в водной питательной среде, содержац1ей источники углерода, азота и минеральные соли, при

20-40 С и рН 6,8-8,0 и выделяют целевой продукт в свободном виде или в виде продукта конденсации с альдегидом, или в виде гидратов известными приемами,