Способ получения -галактозидазы

Авторы патента:

C12D13/10 - Биохимия; пиво; алкогольные напитки; вино; уксус; микробиология; энзимология; получение мутаций; генная инженерия

, и

", д щ уяа 145А (l l) 584802

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советскик

Социалистических

Республик

К ПА1ЕИТУ (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл. д

С 12 Р 13/10 (22) ЗаЯвлено 21.11.75 (21) 1818226/2191452

/13 (23) Приоритет 090872 (32) 30.03.72 (33) сн)А

Мудврствввньй кенвтет

Свавтв Меввтрвв NN вв диан езвбрвтвквв и вн нтмм (3l) 239741 (43) Спублнковано 15.1277, Бюллетень №46 (53) УДК 577.15.

663. 1 (088. В) (45) Дата опубликования описания 1001.78

Иностранцы

Хидео (узуки, Харуми Кобаяси, Есико Озава и Акира Камибаяси (Япония) Иностранная фирма Эйдженси оф. Индастриал Сайенс энд Текнолоджи (Япония) (72) Авторы изобретения

Pll) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ В(, -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ.

Изобретение относится к технике получения. «(-галактозидазы, продуцируемой микроорганизмами, и может быть использовано s микробиологической промышленности для получения энзимного препарата, разлагающего рафинозу, содержащуюся в свекловичной мелассе, иа галактозу и сахарозу.

Известен способ получен я сС -галактозидаэы путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные солиЕ1/ . Получаемая известным способом 4 -галактозидаза обладает недостаточно высокой активностью.

С целью повышения активности «5-ra лактозидаэы согласно предлагаемому способу из продуцентов используют штаммы .Щв1дм «еейаии ИФО 5874, МЬЫсиа «е@ЫеМе Ж 8084, АЬ«МЧИ

М В « а . ИФО 8082, %Майа ю а

ИФО 8033. ЖЬ,Фа Ь.ЬМ„;,„(ИФО 4009 или 3Веййа t4chtheinii

ИФО 4010, при этом в питательную среду вводят один из сахаровс мелибиоэу, рафинозу или галактозу в количестве 0,5-1,5В к весу питательной среды.

Способ осуществляется, следующим образом.

Продуценты из рода i Меы4ьаштаммы дЬм йа r efeexa; ИФО 5874, pbs(cha ° 1+n(at <е ИФО 8984, дьяк а

hgaMspo ИФО 8082, Absid ct e à, ° тиос ИФО 8083, .%ЬзЖа с(сЫЬей и

"ИФО 4009 или; 3bsidia Bcht@e1mi

ИФО 4010 культивируют на питательной

10 среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные сЬли и сан иэ сахаров: мелибиозу, рафиноэу Йли галактозу в количестве 0,5-1,5е к весу питательной среды, получая при

15 этом «С -галактозидазу повышенной активности.

Б качестве источника углерода для роста мицелия используют глюкозу, в качестве органического источника азо20 та вЂ” кукурузный настой, солод, солодовый экстракт, дрожжевой экстракт, рисовую шелуху, рыбную муку и маис и источники неорганического азота.

Источники минеральных веществ вЂ” суль25 фат магнйя, фосфат натрия и хлористый натрий.

К указанным веществам добавляют биотин или любой другой катализатор роста или добавляют источник оргаЗО нического азота. рН среды устанавли584802

Таблица 1

Углевод

1алактоза

Лактоза

Иелибиоза

Рафиноэа

37240 вают 4-8, предпочтительно 5-7. Температура культивирования и период зависят от рода микроорганизма и состава культуральной среды, в случае культивирования при перемешивании достаточно 40-60 час при 30 С.

По окончании куль гивирования мицелий отделяют фильтрованием, промывают водой и измельчают или обрабатывают аз толизом. Извлеченный иэ мицелия энзим можно применять как энзимный препарат.

Отфильтрованный мицелий можно добавлять к свекловичной мелассе для разложения содержащейся s ней рафиноэы. Кроме того, можно мицелий набивать в сосуд и пропускать через него свекловичную мелассу для разложения рафиноэы.

Пример 1. Сахариды (ксилоза, арабиноэа, рамноза, глюкоза,, манноза, фруктоэа., галактоза, мальтоза, целлабиоза, лактоэа, мелибиоэа, сахароза, рафиноза, растворенный крахмал, дек стрии) в количестве 1% добавляют к различным порциям культуральной среды, содержащей компоненты (вес.Ъ):. глюкоза lg кукурузный настой 1 ра ),Ьо 1 инрО4 6 З МцЗО4 7н о 0 2

КЛ 0,2; С0 0,3.

Культуральную сред у засевают спорами вида ЯЬзкйа ееаеха ИФО 5874 и культивируют при взбалтывании 72 час при 30 С со скоростью 140 об/мин.

Затем отделяют мицелий, промывают его водой и растирают в ступке с морским

Результаты, приведенные в табл. 1, показывают что при продуцировании

@(» галактозидазы лактоза дает лучший: показатель.

Пример 2. Спорами щтаммов

3lbgdia укаэанными вьпае, засевают различные порции культуральной среды,,содержащей следующие. компоненты, вес.Ф лактоэа 1; глюкоза 1 (ИН4)2Э34, кукурузный настой 1t К НрО 0 3

2 4

24(З0 ти О 0,2; 44 щ 02 и СаСО

0„3, Культивируют согласно примеру 1. песком до получения пасты. После этого суспендируют в воде такого же объема, как культуральная жидкость.

Далее суспензию, принимаемую эа раствор энэима, испытывают íà oC-галактозную активность, которая представляет собой энзиматическую активность мицелия, полученного иэ 1 л культуральной среды, Энзиматическ ю активность суспенэии мицелия определяют путем добавления,1 мл суспензии и смеси 0,06 И,мелибиоэы и 0,5 мл

0,1 И фосфатного буФерного раствора при рН 5,2 и реагирования в течение

2 час при 40 С, последующего нагревания смеси в кипящей водяной бане для инактивирования энзима, добавления к реакционному раствору 1 мл

1,8%-ного На(он) -8н20 и 1 мп 2Ъ-ного

ЕпЬО 7Н 0 для"удаления протеина, 26 центрифугирования раствора и испытания его верхнего слоя на содержание глюкозы. С учетом пропорциональной зависимости содержания глюкозы, освобождаемой иэ мелибиоэы, и концентрация

Я5 энэима от содержания 1000 мкг глюкозы сусгензию заранее разбавляют для попадания в предел измерения, удовлетворяющий этой зависимости. Количество свободной глюкозы умножают на число разбавления, + -галактозидаэную активность, освобождающую

1 мкг глюкозы в указанных условиях, принимают за единицу.

Данные определения продуцирования

4. -галактозидазы приведены в табл.1

Единицы са-галактоэидазы

П лученные культуральные Растворы испытывают на а(. галактозидазную и щ инвертазную активность мицелия, Инвертазную активность определяют путем смешивания 1 мл суспенэии мицелия с 0,5 мл 0,06 И сахарозы и 0,5 мл фосфатного буфера при рН 5 и реагирования при тех же условиях, как при определении аС -галактозидаэной активности. Затем раствор центрифугируют для удаления протеина и в верхнем слое определяют содержание инверторного сахара по методу Сомолжи-Нельсо6@ на.

584802

Сухой вес

100 мп мнцели я, Единицы

М-галактозидаэы с -галактоэидазы на 1 r сухого мицелия инвертана

1 r сухого мицелия инвертазы

446xl0

52000. 6538

400х10

481х10

564х104

1,3

6461

1,35

6444

6500

6571

li 40

29000

514xl0

ЗООх104

1у 40

6428

6462

15000

1,За

207х104

1,40

210

Таблица 3 рН культурального раствора

Единицы о -галактозидазной активности

9800

6 1

6,0

6,3

6,1

5,8

Инвертазную активность, продуцирующую 1 мкг сахара в указанных условиях, принимают за единицу.

Сухой вес мицелия определяют после сушки при 105 C количества мицелия, Для сравнения культивировали споры Мо ИввеИа чИмссс и полученный раствор испытывали, при этом установили, что штамм рода Absidia обладает большей еС -галактоэидазной активностью и более низкой инвертазной активностью.

Для штамма Мэйси еС-галактоэидазная активность, которой обладает

1 r сухого мицелия, больше инвертаэной активности, адля штаммаАЬ ИеееИа м1ааже . - инвертазная активность больше 6 -галактозидаэной.

Пример 3. В 10 л воды растворяют (r) 120 глюкозы; 1 20 (4Н411 04 ю

Время культивирования, мин выросшего в 100 мл культуральной сре-ды.

Данные определения приведены в табл. 2.

Т а б л и ц а 2

12о кукурузного настоя; 36 ЫН РО

ЗО 24 МЦ$0 ЧН О,;24 МаСВ и 36 СаСО

Раствор помещают в ферментатор и стернлиэуют ЗО мин при 120 С, затем охлаждают до 30 С и разбавляют стерилизованной дистиллированной водой до

35 общего объема 12 л. В растворе культивируют штамм JLbsidia ref hexa ИфО

5874 при перемешиванни со скоростью

300 об/мин и пропускании воздуха

3 л/мин. Затем отбирают образцы проб

4@ и испытывают на Ф(, -галактозкдаэную активность и рН культурального раствора.

Данные испытаний приведены в табл.З

63000

Т а б л и ц а 4 рй культурального раствора

Время культивирования, мин

5в80

5,50

5,20

134

6,40

1240

6,50

4030

6,60

69000

5,50

Из результатов табл. 3 видно, что для штамма 3bsidia ИЕеха ИФО 5874 достаточно 42 час культивирования.

Яо окончании 42 час культивирования

sec сухого мицелия, полученного кэ

100 мл культуральной среды, составляет 1,36 r.

Иэ данных табл. 4 видно, чтс для

МТ ЛЬЫК ado эрМ ИФО 8082 достаточно 54 час культивирования, прк этом вес .сухого мицелия, полученного кэ 100 мл культуральной средыв сос- 46 тавляет 1,35 r.

Следующие далее примеры характе риэуют применение экэима для разложения рафинозы.

Пример 5. Мелассу (СтеФфена) @ разбавляют водой до 30 Врикса к добавкой серной кислоты рН доводят до 5q2

В 200 г полученного раствора, содержащего 5,8 r рафйноэы, добавляют мицелий йЬМЙо жйвй ИФО 5874 с сухим весом 2,9 г и 174 ° 10 ед галактозидазной активности, полученный согласно примеру 2, дают реагировать при 50"С и перемешивании в течение

2 час 30 мин. По окончании реакции @ мкцелий отделяют фильтРованием и промывают водой, фкльтрат и промывные воды объединяют.

Определенный объем этой смеси испытывают хроматографией на бумаге на Ве

Пример 4. Штамм: Absidia hga

EoSPm a ИФО 8082 культивируют соглас- но примеру 3, затем определяют зависимость между длительностью культивирования и количеством образовавшейся

g(. -галактозидаэы.

Данные опытов приведены в табл.4Единицы сА;галактозидаэы содержание остаточной рафинозы и сахаровы, для чего образцы проявляют в растворителе, содержащем,(ч.) 6 н-бу. тайола, 4 пиркдина и 3 воды. Фракции рафиноэы и сахароэы промывают и кспытывают по цистеинкарбаэольному про;.. цессу, при этом устанавливают, что

78% от первоначального содержания рафинозы разлагается, а содержание сахарозы увеличивается на 2,41 r..0 р и м е р 6. Иицелию Abakdia уеЮехс ИФО 5874 с 174-10 ед оС-галактозидазной активности, полученному согласно примеру 5, дают реагировать с 200 r мелассы, разбавленной до 30

Брикса и приготовленной согласно примеру 5. После реакции мицелий промывают водой н добавляют к новой порции мелассы. Таким образом мицелий используют для пяти обработок. Полученные разложенные растворы испытывают на содержание остаточной рафинозы и на содержание сахарозы.

Данные испытаний приведены в табл. 5..

584802

Таблицa5

Номер раствора после обработки

Степень разложения рафиноэы, %

Увеличение количества сахарозы, г

78,5

2,48

79,0

2у58

77,8

2,41

76,0

2,37

75,1

2,41

Таблица б

Оптическая плотно при длине волны, 200

0i414

0,302

О, 515

О, 348

О, 430

О, 310

280

Пример 7. Мелассу Стеффена разбавляют до 50 Брикса и Моводят серной кислотой рН до 5,2.

В 200 г этого раствора, содержащего 9,66 г рафинозы, добавляют мицелий МЬыс6а жереха ИФО 5874 с сухим весом 6,5 г и 2898 ° 10"ед юС-галактозидазной активности, полученный согласно примеру 2. По окончании реакции определяют степень разложения рафиноэы и увеличение содержания сахароэы, которые равны соответственно

56,2% и 3,03 г

Пример 8. В 100 мл мелассы, содержащей 3 87 r рафинозы и разбавленной до 50 Брикса, с рН 5,2 добавЬ ляют мицелий ЛЬйММ Re>si ИФО 5874

Иэ данных табл. 6 следует, что в случае применения двух родов мицелия с одинаковой g -галактоэидазной активностью для разложения рафиноэы количество компонента, выделяемого мицелием, меньше в случае ЛЬьЫнм

t eftexa . ИФО 5 87 4 .

Предлагаемый способ получения

-галактозидазы по сравнению с иэвестОстающаяся сС.вЂ” галактоэидаэная активность, % с сухим весом 1 74 r и 775 10 ед

-галактоэидаэной активности при

50 С в течение 10 час.

По окончании разложения компонент, выделенный мицелием, разбавляют водой

1:1000 и испытывают при длине волн

260 и 280 нм на оптическую плотность.

В таком же растворе мелассы при аналогичных условиях подвергают реакЗО ции мицелий Мо йеоеОа Й сси сухим весом 3,730 r и 774 ° 10"ед 4С -галактозидаэной активности. Разложенный раствор испытывают на оптическую плотность при 260 и 280 нм. Контрольным

36 образцов служит меласса с неизменными свойствами °

Данные испытаний приведены в табл.б ныл решением той же задачи обеспечивает получение энзимного препарата с достаточно высокой P галактоэи® дазной активностью и пониженной инвертаэной активностью на единицу веса энэимного препарата для разложения рафиноэы, содержащейся в свекловичной мелассе, на галактоэу и сахароэу, и

Я увеличение выхода сахароэы.

584802

Формула изобретения

Составитель Т. Серебренникова

Техред М.Келемеш КорРектоР Е. Папп, Редактор Е. Корина

Заказ 4628/721 Тираж 54 1 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения -галактозндазы путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли„ отличающийся тем, что, с целью повыаения .активности C -.галактоэидаэы, иэ продуцентов используют штаммы . 3bskdia валаха

ИФО 5874,,4Ьэ1сйа жДяй чв - ИФО 80ф4, ЗЬз1сИа,%pitchy ИФО 8082 ЗЬв .ИФО 8083, Absidia

hchtheitni ИФО 4009 или A1ssidia ЙаИ1Не щ ИФО 4010, при этом в питательную среду вводят один из сахаров: мелибиозу, рафиноэу или галактозу в количестве 0,5-1,5В к весу питательной среды.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент США В 3647625, кл.

195-11, 07.03.72.