Способ получения альбумина

 

ОП И

САНИЕ

Союз Советских

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заивлено 04.07.73 (21) 1938073/13 (51) M. Кл

А 61 К 37/02 (23) Приоритет (32) 05,07.72 (31) 722431 1 (33) франция (43) Опубликовано 30.01.78. Бюллетень № 4 (45) Дата опубликования описания 09.01 t

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий (53) УДК615.45:

:612.12.1 (088.8

Инос тр анцы

Робер Плян, Жак Лиото, Мари-Франс Макюля, Поль Гатель, Жан Пля и Андре Дебрю (Франция) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Энститю Мерье" (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬБУМИНА

Изобретение относится к получению лекарственных препаратов.

Известен способ получения сывороточного альбумина из растворов, содержащих альбумин, путем нагревания очищаемого раствора не менее 20 мин при температуре 45 — 75 С в присутствии каприлат-иона 0,0075 — 0,02 М концентрации и рН 4,8 — 5,7 отделения осадка коагулированных белков центрифугированнем, осветления и концентрирования очищенного альбумина известными приемами (1).

Однако известный способ является трудоемким, а получаемый продукт содержит примеси.

С целью упрощения технологии производства альбумина и выделения примесей по предлагаемому способу перед термокоагуляцией раствор концентрируют, например, осаждая альбумин, добавлением трихлоруксусной кислоты -до концентрации от 3 до 10 ° 10 моль/л в присутствии этилового спирта концентрацией от 40 до 60%, растворяют в воде осадок альбумина, примеси удаляют. в присутствии этанола концентрацией от 55 до 75% путем добавления трихлоруксусной кислоты, и после удаления осадка доводят рН до 6,5 — 7,0 для осаждения альбумина, затем растворяют его в воде.

Для термокоагуляции в присутствии каприлата натрия, составляющего 15% от содержания протеинов, рН устанавливают в пределах

485 — 495, при 20% рН вЂ” 495 — 505, . при

30% рН доводят до 5,15.

С целью удаления большей части примесей гемоглобина перед концентрированием добавляют углеводород, содержащий галогенпроизводные, например, хлороформ в присутствии эта иола.

10 Способ получения очищенного альбумина, в частности альбумина человека, из раствора очищаемого альбумина, содержащего чужеродные или денатурированные протеины, заключается в том, что осуществляют термокоагуляцию нежелательных элементов путем нагрева1 ния раствора в присутствии каприловой кислоты до температуры 52 — 64 С, предпочтительно между 56 — 60 С. Термокоагуляцию проводят, например, 1 ч в присутствии каприлата натрия, составляющего 15 — 30% от содержания протеинов в растворе, при рН между 4,8 — 5,25.

Каприловую кислоту вводят в виде каприлата натрия, но можно вводить и в чистом виде.

Величина рН тем больше, чем больше содерх.ание каприлата по отношению к протеинам.

Термокоагуляция позволяет устранить больй5 шую часть гемоглобина и осадить денатури591126

3 рованный BJlbovMHH, а также чужеродные l1poтеины.

Если исходный раствор плазматического происхождения, то предлагаемым способом получают очищенный альбумин, пригодный для непосредственного применения. Если же исход- 5 ный раствор содержит чужеродные примеси, например из плаценты, плацентарной крови или. гемолизной крови, то перед термокоагуляцией удаляют большую часть гемоглобина, ферментов, таких как щелочные фосфатазы, путем осаждения протеинов с помощью кислоты, например трихлоруксусной или полифосфорными кислотами, а также удаляют наполнители различных групп.

Гемоглобин удаляют в присутствии этанола в концентрации 60О/р с добавлением галогенированного углеводорода, такого как хлороформ.

Ферменты (такие как фосфатазы) удаляют после удаления гемоглобина в присутствии этанола в концентрации до 60 /р, например

25О/о, с добавлением трихлоруксусной кислоты.20

Концентрация кислоты может быть в пределах от 3 до 10 10 моль/ t, предпочтительно 4,2 10 моль/л. Кислоту добавляют в протеиновый раствор при температуре ниже 0 С, предпочтительно (-5) — (-10) С, до полного осаждения протеинов. В некоторых случаях трихлоруксусную кислоту можно заменить полифосфорной.

Удаление наполнителей различных групп осуществляют при концентрации этанола выше

55 /О, например 75 /о, и концентрации протеинов преимущественно меньшей или равной 10 г/л, 30 добавляя трихлоруксусную кислоту в раствор при температуре ниже 0 С, например (-5)— (-10) С. Концентрация трихлоруксусной кислоты 810 моль/л. Полученный осадок удаляют.

На этой же стадии удаляют также щелочные фосфатазы, если они присутствуют.

Пример. Из 7 т плаценты получают известным способом плавающий на ее поверхности глобулин путем осаждения его этанолом.

Для увеличения гемоглобина верхний слой, 40 содержащий — 58 г протеинов на 1 кг плаценты, добавляют 25 /о-ный этанол и хлороформ так, чтобы весь объем (- 17000 л) содержал

О,бо/о хлороформа; рН доводят до 6,0 — 6,1.

Верхний слой в этих условиях поддерживают при температуре 24 С. В результате образуется 45 осадок, который отделяют и выбрасывают, удаляя большую часть гемоглобина. Объем верхнего слоя уменьшается до 16000 л (в этот момент выход протеинов 8 r/êã). Для удаления ферментов в верхний слой (16000 л) добавляют

25 /р-ный этанол и трпхлоруксусную кислоту 50 концентрации 4,2 10 - моль, l) температуру до добавления понижают до -80 С. Получают осадок около 1000 кг (выход протеинов 4 г/л), который удаляют, применяя герметичные центрифуги с непрерывным выбросом осадка.

Верхний слой уменьшается до 15000 л. Таким образом удаляют или денатурируют гцелочные фосфатазы и другие ферменты, такие как трансамилазы.

Осадок снова растворяют в воде и объем доводят до 1800 л водой.

Затем производят осветление. Для этого повторно растворенный осадок наполняют кремниевым порошком (аэросил) в концентрации 0,2О/р. Образуется осадок — 50 кг, который отделяют центрифугированием. Осветленный плавающий сверху раствор соответствует выходу протеинов около 6,5 г/кг.

При удалении групповых наполнителей осветленный раствор разбавляют смесью

750/о-ного этанола и трихлоруксусной кислоты концентрацией около 8.10 моль/л. Содержание протеинов 10 г/л. Температуру поддерживают около -7 С. В результате групповые наполнители выпадают в осадок — 10 кг, который удаляют. На этом этапе удаляют также остаточные ферменты.

Далее верхний слой, содержащий около 8 r протеинов на 1 л, фильтруют, рН доводят до 6,5 — 7, температуру поддерживают между

-5 и -10 С. Образуется осадок альбумина

140 кг, который центрифугируют, а верхний плавающий слой удаляют. Очищают альбумин путем повторного растворения осадка в воде, получают объем 280 л, выход протеинов

5 г/кг.

После диализа в дистиллированной воде доводят содержание протеинов до 20 г/л, добавляют в раствор каприлат натрия концентрацией 2,41 10 моль/л и доводят (при помощи уксусного тампона) рН до 5 0 — 5,05. Этот раствор выдерживают при температуре 60 С около часа. Оставшиеся протеины, кроме альбумина, коагулируют и выводятся в осадок с последними следами гемоглобина, также как денатурированная часть альбумина. В растворе остается лишь практически чистый альбумин.

Затем верхний слой доводят до 1750 л и фильтруют. Разбавленный раствор альбумина концентрируют, добавляя 40О/р-ный этанол при рН 4,8 — 4,9 и температуре -8 С. Получают осадок, который собирают и повторно растворяют.

Новый раствор диализуют, обрабатывают глиноземным гелем, концентрируют в вакууме, после чего проводят стерилизирующую фильтрацию и получают 95 л концентрированного практически чистого альбумина с содержанием

200 г/л. На этой последней стадии выход протеинов 2,7 r/êã. Полученный альбумин можно применять для терапевтических целей в медицине.

Формула изобретения

1, Способ получения альбумина из раствора альбумина, содержащего чужеродные и денатурированные протеины, путем нагревания раствора, подлежащего очистке, при температуре между 52 С и 64 С включительно в присутствии каприлата натрия при рН между 4,8 и 5,25 включительно, сепарации с помощью центрифугирования из осадка коагулированных протеинов, осветления и концентрации очищенного альбумина известными методами, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии производства и выделения примесей, перед термокоагуляцией раствор концентрируют, например, осаждая альбумин добавлением трихлоруксусной кислоты до концентрации от 3 до 10 10 2 моль/л в присутствии этилового

591126

Составитель С. Малютина

Техред О. Луговая Корректор А. Гриценко

Тираж 7ОЗ Подписное

Редактор Н. Хубларова

Заказ 247/1

UHИИПИ Государственного комитета Совета Министров CC СР по делам изобретений н открытий

1! 3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4 спирта в концентрации от 40 до 60о/о, растворяют в воде осадок альбумина, затем примеси удаляют в присутствии этанола в концентрации от 55 до 75 /о путем добавления трихлоруксусной кислоты и после удаления осадка доводят рН до 6,5 — 7,0 для осаждения альбумина, затем растворяют осадок в воде.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для термокоагуляции в присутствии каприлата натрия, составляющего 15 /о от содержания протеинов, рН устанавливают в пределах 4,85— г

4,95. при 20"/о рН вЂ” 4,95 — 5,05, а при ЗО /0 рН доводят до 5,15.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью удаления большей части примесей гемоглобина, перед этапом концентрирования добавляют углеводород, содержащий галогенпроизводные, например, хлороформ в присутствии этанола.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент США № 2765299, кл. 260 †1, 1956.