Способ подсчета лейкоцитов

 

ОП ИКАНИЕ

ИЗОБРЕТЕ Н ИЯ

К OATEHTY

Союз Советекии

Социалистических

Республик (и) 611598 е (61) Дополнительный к патенту (22) ЗаЯвлЕно 2Ч.10.71 (21) 1711809/28--13 (23) Приоритет — (32) 30.10.70. (51) М. Ел.-

G 01 N 33 16

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (31) 85333 (33) (43) Опубликовано 15.06.78. Бюллетень N. " (45) Дата опубликования описания l,9,05,78 (53) УДK

611-018.5 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы ,Гудсон Р. Анслей и Леонард Орнстейн (США) Иностранная фирма

"Моунт Синай Рисерч Фаундэйшн" (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОДСЧЕ1 А ЛЕЙКОЦИТОВ

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в диагностической практике для определения содержания лейкоцитов в крови.

Известен способ подсчета лейкоцитов путем фиксации, ферментативного окрашивания и гемолиза 11!.

Однако известный способ не обеспечивает 1 " дифференциального подсчета лейкоцитов от других форменных элементов крови.

Целью изобретения является дифференциальный подсчет лейкоцитов от других форменных элементов крови, например, с помощью фотометрн.

Эта цель достигается тем, что фиксацию цельной крови проводят моноальдегидом с последующим гемолизом и окрашиваннем цитохимическим. gi субстратом, смешанным с хромогенным сопрягающим реагентом, который не образует внеклеточных макрочастиц, добавлением буферной смеси для регулирования рН и подогревом полученной смеси от 20 до 55 С в течение 1 — 10 мин. 25

Кроме того, при окрашивании нейтрофилов и эозинофилов, в качестве цитохимического окрашивающего субстрата используют перекись, а хромотенного сспрягающего реагента — 4- хлор-1-нафтал, а для окрашивания моноцитов в качестве цитохимического окрашивающего субстрата HcIIoJlbзуют альфа-нафтилбутират, а хромогенного сопрягающего р. агента — гексазоний — парароэанилин.

Способ осуществляют следующим образом.

Добавляют цитологический фиксирующий реактив к раствору, содержащему белые кровяные клетки (например, цельную кровь) для умерщвления содержащихся там кровяных клеток и иммобилизации содержащихся з клетках каталитических энзимов.

Предпочтительными являются пробы жидкости организма, такие. как цельная кровь и спинномозговая жидкость. После добавки фиксирующего реактива раствор обрабатывают особым цитохими-. ческнм веществом, хромогенными осаждающим копулирующим реактивом и буфером.

Цитологический фиксирующий раствор представлчет собой преимущественно 0,2 — 40%-ный водный раствор моноальдегида, такого как формальдегид, бутиральдегид, пропиональдегид и апет. альдегид. Лиальдегиды непригодны, так как обуслов611598

60 ливают сетчатую структуру и вызывают внеклеточ ные осаждения.

Концентрация моноальдегида должна быть достаточно высока для умерщвления клеток, однако, беэ нарушения активности энзим.

Низкие концентрации при низких температурах требуют дополнительного времени. Так, например, при концентрации формальдегида в растворе равной 2%, при 4 С требуется 12 ч, а при 4%-ной концентрации при 50 С требуется 2 мин.

Так как обычно смешивают равные объемы жидкости организма и раствора моноальдегида, крепость альдегидного раствора является двойной по сравнению с концентрацией во время фиксаиии альдегида в растворе.

Предпочтительным является 37%-ный раствор формальдегида.

Когда жидкость организма, содержащая лейкоциты, представляет собой цельную кровь, то необходимо осуществить гемолиз лейкоцитов, так как существует опасность, что совпадающее прохождение двух или большего количества красных клеток через фотометрическую счетную станцию ошибочно может быть принято как окрашенные лейкоциты или ненормальные клетки. Для этого осуществляют гемолиз красных кровяных клеток путем добавления реагента к суспензии клеток, чтобы обусловить разрыв только красных клеток и выделение их содержимого (например, гемоглобина) в .раствор.

Гемолиризующие реагенты не должны свертывать взвешенные клетки и не должны мешать протеканию любых последующих гистохимических реакций путем, например, взаимодействия с какими-либо соединениями, используемыми для окрашивания клеток на последних этапах.

Гемолиз проводят либо до, либо после окрашивания. Если гемолиз проводят после окрашивания, то это не должно существенно изменять окраску или изменять окрашенные или неокрашенные лейкоциты.

Гемолиз проводят введением в раствор, содержащий красные и белые кровяные клетки, водного раствора алифатической кислоты с величиной рН ,3,0 — 5,5. Удовлетворительные результаты дает применение уксусной, пропноновой, масляной и молочной кислот в концентрации 1 — 10%.

Предпочтительным является раствор уксусной кислоты концентрации около 7%, Раствор может быть нагрет до температур, начиная от 40 (в течение 8 мин) до 55 С (a течение 1 мнн), чем достигается инактивация энзима катализы, снижение псевдопероксидазной активности гемоглобина и ускорение гемолиза. При более низких температурах для реакции требуется больше времени. Использование еще более высоких температур инактивирует энзимы пероксидаэы и ускоряет свертывание после введения гемолиэирующего реагента.

Окрашивание клеток требует тщательного вы- бора реактивов. Используют большое количество известных цитохимических субстратов. Так для окрашивания клеток, содержащих пероксидазу, таких как эозинофилы или нейтрофилы, применяют смесь неорганической или органической перекиси и 4-,хлоро-1-нафтала. Перекись и 4-хлоро-.1-нафтал служат в качестве энзимных субстратов, а 4-хлоро-1° нафтал служит также в качестве копулирующего реагента. 4-Хлоро-1-нафтал производит темно-синее окрашивание внутри содержащей пероксидазу клетки без введения отдельного хромогенного осаждающего копулирующего реактива. Можно также использовать смесь о-толидина и 4-õëîðî-1-нафтала для получения пурпурно-красного красителя, если используемый на ступени фиксирования формальресид инактивирован.

Для избирательного окрашивания контролируют рН раствора. Если рН раствора ниже 3,0, то тяжелые осадки красителя образуются только в зозинофилах. Если рН раствора находится в пределах 3,0 — 5,0, то тяжелые осадки красителя образуются только в нейтрофилах, Если рН находится в пределах 5,0 — 7,0, то тяжелые осадки красителя образуются только в эозинофилах и нейтрофилах.

Если окрашивают липаэосодержащие клетки, т.е. моноциты, то используют комбинации сложного эфира, нафтола, такого как 1-нафтилацетата или 1-нафтилбутирата и диамониевой соли, например, гексазоний — парароэанилин, который является хромогенным осаждающим копулирующим реагентом; рН для этой реакции окрашивания 5,56 5, предпочтительно около 6,0, при такой рН тяжелые осадки красителей образуются только в моноцитах.

С целью адекватного цветного окрашивання в моноцитах за короткий отрезок времени, например за 5 мин концентрация субстрата должна превышать примерно 0,5 мг/мл в окончательном инкубационном растворе. Сложные эфиры нафтал-AS и их производные и 1-нафтилбутират менее растворимы, чем 0,5 мг/мл, поэтому в них вводят

2,2-оксидиэтанол (диэтиленгликоль) или другие водные спирты или эфиры, например этиленгликоль, пропиленгликоль, диметиловый эфир этиленгликоля и диэтилкарбитоля.

После этого 1-нафтилбутират и 1-нафтилацетат могут быть растворены в концентрациях до

1 мг/мл. Могут быть растворены также и другие субстраты, такие как нафтнлхлорацетат, сложные индоксильные эфиры, такие как сложные эфиры индоксилацетата, индоксилпропионата и индоксилбутирата, сложные эфиры 8-оксихинолина, такие как 8-оксихинолинацетат, 7-оксихинолиниропионат и 8-оксихинолинбутират. При тех же условиях будет растворено только около 0,1 мг/мл нафтал-А$-ацетата, что приводит к значительно более слабому выявлению цветного окрашивания. Другие сложные эфиры производных нафтал-AS растворяются даже в меньшей степени.

611598

Растворы перекиси водорода используют в соединении с упомянутыми растворами 4-хлоро-1-иафтола. Можно использовать большое количеств других органических и неорганических перекисей, например перборат-тетрагидрат натрия, перекись карбоната натрия, перекись пнрофосфата натрия, этилгидроперекнсь, третичная бутилгидроперекись и перекись мочевины, Все онн применяются в конечных концентрациях 0,1 — 0,001% от веса конечной концентрации. 4-Хлоро-1-нафтол используют в конечных концентрациях от 0,001 до 0,06 вес.%:

Реагенты моноцитов

Основные растворы:

2-Нафтилбутират — 1 вес.% в 2,2-оксидиэтаноле;

1,15 М КН РО (двухосновный) 9,07 г/л;

1,15 М К1НРО (двухосновный) около 11,61г/л;

Основной фуксин (например, Matheson, Coleman and Bell) 1 r в 25 мп 2HCI;

2,2-0ксидиэтанол;

01 М К2НР04

1 г азотистокислого натрия в 25 мл воды.

Рабочие реагенты, мл: а — Нафтилбутират а- Нафтилбутнрат (основной раствор) 2,0

2,2- Ок сиди этанол 6,0

1,15 М КН Р04 (одноосновный) 8,0

Этот раствор должен готовиться ежедневно.

Количество основного фуксина используют в конечной концентрации 0,00! — 0,01%.

Для окрашнвания моноцнтов добавляют примерно. 0,32 мл/мин фиксированной формалином пробы а-нафтилбутнрата н около 0,42 мл/мнн гексазоний иарарозаннлнна, для окраски эозинофилов добавляют 0,60 мл/мин красящего раствора ьо и около 0,10 мл/мин 0,06 н. перекиси водорода, 35

Преддочтительны реагируинцие вещества, которые могут использоваться для окрашивания мо. ноцитов, эозннофилов и нейтрофилов:

Эозинофило-нейтрофильные реагенты.

Основные растворы:

0,003 и 0,006 вес.ч. перекиси водорода в воде;

0 05 r 4-хлоро-2-нафтала в 25 мл 2,2-оксидиэтанол.,, 0,1 н. уксусная кислота.

Рабочие растворы ! о

Красный раствор эозинофилов, мл (рНй2,5):

0,1 н. уксусная кислота 40

2,2-0ксидиэтанол (100%) 20

4-Хлоро-1-нафтал (основной раствор)

Концентрированная уксусная кислота 3,4

Эозинофило-нейтрофильный красящий раствор, мл (рН>3,3):

0,1 н. уксусная кислота 40 2О

2,2-OKcngmraH (100%) 20

4-Хлоро-1-нафтал (основной раствор) 13 " 0,42 мл/мин фиксированной формалином гемолизированной пробы.

Как лероксидазному; так н моноцитному окрвшиваиию мешают многие компоненты.

Когда происходит пероксидазная реакция, сыворотка каталаэы может подавлять пероксидазу гранулоцитов и тем самым истощать субстрат.

Каталаэа является лабнльной в отношении нагрева при 50 С, в то время как пероксидаза устойчива до температуры 80 С. Нагрев от 40 (в течение

8 мин) до 55 С (в течение 1 мин) или при других подходящих температурах и в соответствующие отрезки времени на ступени фиксации формалином или после того инактивирует катализу. Предпочтительное время нагрева прн 50 С вЂ” 3 мнн. Разбавление крови в дальнейшем усиливает соотношение внутриклеточной пероксндазнок активности до остаточной концентрации каталазы.

Нагрев раствора крови также разрушает псевдопероксндазную активность гемоглобина.

Препятствующим компонентом в ходе окрашивання моноцнтов является ннгибитор С 1-эстеразы, являющийся компонентом сыворотки, полдерI живающнй ннактнвность С 1-зстераэы. Действие

У ингнбитора С 1-эстераэы может быть блокировано различными способами, например добавлением к пробе смеси гепарнна, разбавлением образца калиевой солью, нормально требуется 50-кратное разбавление. Предпочтительным является добавление

2,2-оксндиэтанола к фиксированной пробе крови в концентрациях 10 — 30%.

Предлагаемый способ обеспечивает более быстрый дифференциальный подсчет лейкоцитов на большом количестве клеток.

Формула изобретения !. Способ подсчета лейкоцитов путем фикса. цин, ферментативного окрашивания и гемолнэа, о т л и ч а ю щ н и с я тем, что, с целью дифференциального подсчета лейкоцитов от других форменных элементов крови, например, с помощью фотометрин, фиксацию цельной крови проводят моноальдегидом, с последующим гемолнзом и окрашиванием цитохимнческим субстратом, смешанным с хромогеннылг соирягающим реагентом, который не образует внеклеточных макрочастиц, добавлением буферной смеси н подогревом полученной смеси от 20 до 55 C в течение 1 — 10 мин.

2. Способ по п.!, о т л н ч а ю шийся тем, что лри окрашиваннн нейтрофилов. н эозннофилов в качестве цитохимичсского окрашивающего субстрата используют перекись, а хромогенного сопрягающего реагента 4- хлор- 1-нафтол.

3. Способ по п l, отличающийся тем, что для окращивания моноцитов в качестве цитохимического окрашиваю пего субстрата используют альфа-нафтилбутнрат, а хромогенного сопрягающего реагента — гексазоний — парарозанилнна.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Ромейе Б. Микроскопическая техника.

1953, с. 314-329.