Способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде и устройство для его осуществления

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

И ЗОБРЕТЕ Н ИЯ. (11) 624164

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ", 1 (61) Дополнительное к авт. свид-ву

2 (51) М. Кл. (22) Заявлено 22.03.77 (21) 2468148/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (01 1 1 33/16

Государственний комитет

Совета Министров СССР

llD делам изооретений и открытий (43) Опубликовано 15.09.78.Бюллетень № 34 (53) УДК 663.576..8 (088.8) (45) Дата опубликования описания О т. 09. ra.

А. А. Аревшатян, Г. А. Гальцова, В. П. Ерохова, С. К. Манешин и М. В. Кулаков (72) Авторы изобретения

Московский ордена Трудового Красного Знамени институт химического машиностроения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЭКЗОГЕННОГО

СУБСТРАТА В ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ И УСТРОЙСТВО

ДЛЯ ЕГО ОСУШЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в различных отраслях народного хозяйства, связанных с выращиванием микроорганизмов, предпочтительно дрожжей.

Известен способ определения содержания

5 экзогенного субстрата в питательной среде, предусматривающий экстракцию субстрата из суспензии микроорганизмов растворителями с последующим спектрофотометрированием полученного экстракта в определяемой области спектра (1), (2).

При определении субстрата из суспензии известными спирт-гексановым (1) и инфракрасным (2) спектрофотометрическим методами, основанными на экстракции субстрата из суспензии микроорганизмов соответственно спирт-гексановой смесью и четыреххлористым углеродом, фотометрирование проводят в инфракрасной области спектра.

Однако известные способы позволяют проводить определение субстрата только дискретно, путем экстракции из суспензии микроорганизмов различными токсичными растворителями без учета физиологического состояния популяции микроорганизмов.

Известен также способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов.

Известно устройство для осуществления указанного способа определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде, содержащее измерительную и сравнительную камеры для анализируемой питательной среды, источник света, двухлучевую осветительную систему, обтюратор, фильтры возбуждения и люминесценции и фоторегистрирующую систему с фотоумножителем (3).

Этот известный способ и устройство для его осуществления являются наиболее близкими к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату.

Указанный способ не позволяет получать непрерывную информацию о физиологически необходимом содержании экзогенного субстрата в непрозрачной водной суспензии микроорганизмов по оксидоредукционным изменениям одного из компонентов дыхательной цепи митохондрий, а известное устройство для осуществления этого способа не обес624164 печивает получения непрерывной информации о характере исследуемой среды и не может быть использовано в непрерывном технологическом процессе, что в свою очередь не обеспечивает достаточно высокой производительности процесса культивирования и высокое качество биомассы.

Целью изобретения является повышение производительности процесса культивирования и улучшение качества биомассы. 10

Поставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, исходную суспензию микроорганизмов облучают монохроматическим светом в интервале длин волн 330 — 370 нм и одновременно измеряют разность интенсив-. ности люминесценции окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида (НАД), содержащегося в клетках микроорганизмов, и в зависимости от получаемой величины по градуировочному графику определяют физиологически необходимое количество субстрата, вводимого в питательную среду при данной степени аэрации.

При этом устройство для осуществления предлагаемого способа снабжено емкостью с барботирующим приспособлением и подводящими трубопроводами для ввода анализируемой питательной среды и окислителя, а также отводящими трубопроводами, один из которых сообщает емкость со сравнительной камерой, а два других осуществляют слив отработанной суспензии, при этом измерительная камера соединена подводящим трубопроводом с источником снабжения анализируемой среды.

Кроме того, для повышения точности измерений измерительная и сравнительная 4п камеры, фотоумножитель, а также фильтры осветительной и фоторегистрирующей систем размещены на интегрирующей сфере.

На фиг. 1 изображена схема устройства для осуществления способа определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде; на фиг. 2 — график зависимости между содержанием парафина в среде (С ) и величиной разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной формы НАД вЂ” (d, 1) .

Устройство для осуществления предлагаемого способа (фиг. 1) содержит источник 1 света (ртутно-кварцевую лампу), двухлучевую осветительную систему 2, обтюратор 3, а также фильтр 4 возбуждения, измерительную и сравнительную камеры 5 и 6 и фильтр 7 люминесценции, размещенные на интегрирующей сфере 8, и фоторегистрирующую систему.

Фоторегистрирующая система содержит фотоумножитель 9, усилитель 10, синхронный детектор 11, дифференциальный усили тель 12 и регистрирующий прибор 13.

B устройстве имеется емкость 14 с барботирующим приспособлением 15, подводящие трубопроводы 16 и 17 для ввода анализируемой питательной среды и окислителя, а также отводящие трубопроводы 18, 19.

Отводящий трубопровод 18 сообщает емкость со сравнительной камерой 6, а отводящие трубопроводы 19 осуществляют слив отработанной суспензии.

Измерительная камера 5 соединена подводящим трубопроводом 20 с источником снабжения анализируемой среды (на чертеже не показан) .

При определении экзогенного субстрата в питательной среде с помощью указанного устройства исходную суспензию дрожжей из ферментера пропускают через проточные светоизолированные измерительную и сравнительную камеры 5 и 6, причем перед подачей суспензии в сравнительную камеру 6 ее пропускают через емкость 14, где осуществляют ее барботаж окислителем (кислородом воздуха) для полного окисления внутриклеточного НАД. С помощью двухлучевой оптической системы 2 формируют два световых модулированных монохроматических потока возбуждающего излучения, которыми поочередно облучают камеры 5 и 6.

Возникающие при этом световые импульсы, обусловленные люминесценцией среды, воспринимаются фотоумножителем 9, располо>кенным в отверстии сферы 8 перпендикулярно направлению возбуждающего излучения. Узкополосный фильтр 7 выделяет вторичное излучение — люминесценцию на заданной длине волны в интервале 430 — 470 нм, фотоумножитель 9 при этом регистрирует монохроматическое излучение один раз от измерительной камеры 5 и второй раз от сравнительной 6. Последовательность импульсов усиливается усилителем 10 и поступает на вход синхронного детектора 11, который обеспечивает разделение сигналов люминесценции от двух камер и преобразование их в уровни напряжения, соответственно пропорциональные этим сигналам. Два уровня напряжения поступают на вход дифференциального усилителя 12. Сигнал на его выходе пропорционален разности этих дв х уровней или же разности люминесценции от двух камер 5 и 6, и регистрирующий прибор 13 обеспечивает непрерывную запись этого сигнала.

При выращивании дрожжей рода Candida guiliermondii исследуют влияние различных концентраций экзогенного субстрата-парафина на изменение разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной форм НАД. Дрожжи выращива624164

Формула изобретения

55 ют в 30л ферментере при температуре 32—

34 С. и рН 4,0 — 4,2 на синтетической среде, содержащей в качестве единственного источника углерода парафины, а в качестве источника калия; магния, цинка, марганца, железа, фосфора -- их минеральные соли при степени аэрации 1200 об/мин мешалки. Концентрацию парафина в среде изменяют в диапазоне от 8 до 0,1 г/л. Контроль за содержанием парафина в среде осугцествляют спектрофотометрическим методом. По результатам полученных испытаний строят график (фиг. 2).

Как видно на графике, существует обратно пропорциональная зависимость между содержанием парафина в среде (C„ I ) и в еличиной разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной форм НАД (h I ) . Следует также, что при увеличении концентрации парафина выше 6 г/л нри данной степени аэрации дрожжи не могут окислить полностью субстрат, что приводит к накоплению его в клетках микроорганизмов и ухудшению качества продукта с одновременным снижением скорости роста микроорганизмов. Предварительно построенный градуировочный график обеспечивает определение физиологически необходимого количества субстрата в суспензии следуюшим образом. Суспензию микроорганизмов с концентрацией сухих веществ не выше 26 г/л наливают в измерительную кювету, которую помещают в светоизолированную камеру прибора, облучают с помощью ртутной лампы монохроматическим светом и измеряют интенсивность флуорссценции в области 430--470 нм. Во вторую сравнитель«Ii Io камеру помешают такую же суспензию, но предварительно ггробарботированну|о, которую также облучают монохроматическим светом и измеряют интенсивность флуоресIIcII IIHII в области 430--470 нм. При этом сле гует следить, чтобы суспензия не расслаивалась. Построив график зависимости h .J от С „,,„определяют участок, где клегки могут потреблять добавляемый субстрат, и уровень насышения, т. е. количество субстрата, физиологически необходимое и остаточное для нормального метаболизма клеток. По показаниям регистрируюшего прибора и абсолютно сухому весу микроорганизмов в.суспензии определяют нормированную величину интенсивности флуорес«cIIIIIIH НА3, по которой с помошью калибровочного графика определяют физиологически неооходнмое содержание субстрата в среде.

При этом разность люмине IIcIIIIHH I3ocстановлен ного (измерительная камера) и окисленного (сравнительная камера) никоти намндадениндинуклеотида составляет 4,5 мв нри концентрации аосолютно сухих дрож.кей I5 г/л. Величина интенсивности лк)минесценции в пересчете на единицу аб5

35 солютно сухих дрожжей равна 0,3 мв на 1 г/л относительных единицах) .

С помощью калибровочной шкалы регистрирующего прибора определяют концентрацию субстрата в среде, которая равна для данного конкретного случая 0,8 г/л. Согласно калибровочному графику данная концентрация ниже функционально необходимой для клеток, поэтому для оптимального ведения процесса биосинтеза содержание парафина в среде надо увеличить до 6 г/л (см. фиг. 1), что соответствует максимальным физиологическим потребностям клетки.

Таким образом, предлагаемый способ определения физиологически необходимого содержания экзогенного субстрата и устройство для его реализации позволяют не только быстро и с достаточной точностью (до+5 !О) контролировать содержание субстрата в среде, но и с учетом физиологического состояния популяции микроорганизмов, определяемого по оксидоредукционным изменениям внутриклеточного фермента НАД, регулировать в зависимости от степени аэрации содержание субстрата в среде, необходимое для обеспечения максимальной скорости роста микроорганизмов и улучшения качества продуктов, т.е. предлагаемый способ и устройство позволяют вести процесс в оптимальных условиях.

Технико-экономический эффект при IIcпользовании предлагаемого способа и устройства для его выполнения создается благодаря ведению процесса при оптимальных условиях с получением продукта высокого качества, экономии сырья и точного и объективного измерения содержания субстрата в суспензии микроорганизмов.

1. Способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов, предпочтительно дрожжей. отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса культивирования и улучшения качества биомассы, исходную суспензию микроорганизмов облучают монохроматическим светом в интервале длин волн 330 — 370 нм и одновременно измеряют разность интенсивностей лгоминесценцин окисленной и восстановленной форм никотIIнамидадениндинуклеотида, содержащегося в клетках микроорганизмов, и в зависимости от полученной величины по градуировочному графику определяют физиологически необходимое количество субстрата, вводимого в питательную среду при данной степени аэрации.

2. Устройство для осуществления способа по п. 1, содержащее измерительную и сравнительную камеры для анализнрования

624164 ег ф

Фиг. Г

11НИИПИ Заказ 5175/35 Тираж 112 Подписное

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4 питательной среды, источник света, двухлучевую осветительную систему, обтюратор, фильтры возбуждения и люминесценции и фоторегистрирующую систему с фотоумножителем, отличающееся тем, что оно снабжено емкостью с барботирующим приспособ.лением и подводящими трубопроводами для ввода анализируемой питательной среды и окислителя, а также отводящими трубопроводами, один из которых сообщает емкость со сравнительной камерой, а два других осущест вляют слив отработанной суспензии, при этом измерительная камера соединена подводящим трубопроводом с источником снабжения анализируемой среды.

3. Устройство по п. 2, отличающееся тем, что с целью повышения точности измерений, измерительная и сравнительная камеры, фотоумножитель, а также фильтры осветительной и фоторегистрирующей систем размещены на интегрирующей сфере.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Санин П. И., Ципугина Н. Н., Сучкова А. А., Сущик P. Я. «Микробиологическая

tO промышленность», № 1, 1972, с. 38 — 40.

2. Андреев Н. С., Сидорова И. П., Найдин А, В . «Микробиологическая промышленность», № 4 1976, с. 14 — 17.

3. Патент США № 3249754, кл. 250 — 83.3, 1966.