Реактив для ферментативного определения холестерина

 

ОП ИСА

НИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Соцналмстимеских

Республик (11) 61373 1 (61) Дополнительный н патенту (22) Заявлено 04. 12.74(21) 2084151/28-13 (23) Приоритет - (32) 16.08.74 (31) P 2439348.4 (33) (43) Опубликовано 30 06 78 юллетень № 24 (51) М. Кл, &01 И 33/16

Государстаенимй комитет

Совета Министров СССР по делам кзобретеихй и открытей (53) УДК 616.711 16 (088. 8) (45) Дата опубликования описания i5. 6,7о

Иносъранны

Петер Рашлау, Гунтер Ланг, Клаус Беаукамп, Эрих Бернт и Вольфганг Грубер (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Инос е анная фирхеа Берингер Маннхайм ГМБХ (ФРГ) (71) Заявитель (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ФЕРМЕНТАЧИВНОГО ОПРЕ,ВЕЛЕНИЯ

XOJKCTEPHHA

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим средствам.

Известен реактив для ферментативного определения холестерина, содержащий холестериноксидазу, поверхностно-активное вещество и солевой буфер.

Однако известный реактив не обеспечивает быстроты анализа.

Целью изобретения является ускорение ана- лиза.

Эта цель достигается тем, тто реактив со- !О держит указанные компоненты в следующих" количествах, вес. %:

Холестериноксидаза 0,025 — 0,500

Поверхностно-активное вещество, преимущественно гидроксинолиэтоксидекан 0,0! 0 — 1,000

Солевой буферный раствор, преимушественно 0,5 н.фосфорнокислый калий Остальное

В качестве поверхностно-активного вещества с липофильными и гидрофильными свойствамн применяют,неионогенные детергенты, содержагние минимум одну группу OH в молекуле. Предпочтительными являются производные полиоксиэтилена алкиловых, ариловых и т аралкиловых спиртов. Этими соединениями являются: полиоксиэтиленалкиловый эфир, сложный полиоксиэтиленалкиловый эфир угольной кислоты, сложный полиоксиэтиленсорбитаналкиловый эфир угольной кислоты, полиоксиэтиленалкиламины; полиоксиэтиленполиокснпропиленовые блокполимеризаты, простой полиоксиэтнленалкиловый тиоэфир, простой полиоксиэтиленалкилариловый эфир. Можно также использовать гидрооксиполиэтоксидодекан, аддукты окиси этиленалкилфенолов; производные по- . лиэтоксиэтилена сорбитангидридов, а также производные полиоксиэтилена меркаптанового ряда. Из неионогенных поверхностно-активных соединений пслиоксиэтилена пригодны такие, которые имеют уравновешенное соотношение гндрофобного остатка и цепи полиоксиэтилена и которые водорастворимы. Эти соединения вводят в количестве от 0,005 до О, I вес.

Поверхностно-акти вн ы ми вещества м и, содержащими минимум одну rpyriny OH, являются и бутилди|ликоль и гексиленгликоль. Эти спирты можно добавлять для стабилизации в относительно больших количествах — от О до 20 об. %. Их пригодность каждый раз определяют экспериментально. г

В качестве анионных смачивающих средст» используют срли желчных кислот, таких как

613731 холевая, таурохолевая и деэоксихолевая, а также соли кислот жирного ряда и саркозиды жирных кислот, Используют .и производные серной кислоты, которые обладают дополнительным свойством стабилизировать известные остаточные продукты окисления некоторых индикаторов (o-толйдин, гетероциклический азин), например сложйый эфир сульфоянтарной кисло. ты алкиларпловые сульфонаты, алкиловые сульфонаты, алкнлполиоксиэтиленсульфаты.

Иэ катионных смачнвателей пригодными являются соли алкилпирндина или триметиламмония, а также соединение хлорид бензотония.

Иэ амфотерных смачивателей применяют, напргмер, имндазолбетаин, а также натрий-ди- (2-этилгекспл) -сульфосукцинат, додецилсульфат натрия, олеат натрия, хлористый бенэал-, коний и хлористь:й цетилпиридиний, Ионны илн амфотерные.смачиватели при-. меняют в комбинации с пеионными.

Купонные сма игватели, содержащие минимум одну группу ОН, обладают примерно в 5—

10 раз большей активностью и позволяют получить соответствующее увеличение скорости течения реакции или сокращение ее длительности по сравнению с другими поверхностноактивпыми веществами. Они эффективны и в малых количествах.

Количество доба6ляемых Ьоверхностно-активных веществ заВисит от их молекулярного веса и степени гидрофобности и гидрофильности. Слишком малое количество не дает нужного эффекта активации, а слишком большое— ведет к денатурированию фермента.

Оптимальные концентрации для каждого пригодного .поверхностно-активного вещества определяют экснериментально. Например, для гидроксиполиэтоксидодекана они составляют

0,15- — О,б вес. о, аддуктов окиси октилфенолэтилена от 0,03 до О,l ьес. О/о, для производных нолиоксиэтилена сорбитангидридов от 0,15 до 0,6 вес. %, для дезоксихолата натрия от

0,03 до 0,05 вес. %, для аддуктов окиси алкилфенолэтилена меркаптанового ряда (например, стерокс SE) от 0,005 до,0,02 вес. %.

Реактив для определения холестерина представляет собой раствор, содержащий холестериноксидазу, систему для определения пере- киси водорода, буферный раствор и поверхностно-активное вещество, которым пропитывают .носитель, синтетическую пленку или нх обо. лсчку. Поверхностно-активное вещество содержится в концентрации от 2 до 30%, преимущественно 10 — 20%,.по отношению к твердым реактивам. Предпочтительной системой для выявления перекиси водорода является система, .состоящая из перокеидаэы, окислительного ин.дикатора, агента набухания или стабилизатора

Чтобы приготовить реактив для выявления холестерина в сыворотке крови, используют обычную бумагу для тестов, которую гидрофобируюг или покрывают полупроводящей мембраной из сложных эфиров целлюлозы или используют пленки для тестов. Для изготовленни последних холестериноксидаэу, пероксидаю. б;иЬевный паствор, индикатор, агенты набухания вместе с поверхностно-активными веществами смешивают в водную дисперсию пленкообразующего полимера.: Эту дисперсию намазывают тонким слоем на бумагу и высушивают. Если содержащую холестерин кровь накапать на такой. слой реактива и стереть ее примерно через одну минуту,. то реактив окрашивается, и глубина окраски зависит от количества холестелина;

Реактив пригоден также для выявления и определения содержания свободного холестерина. Если же имеются сложные холестериновые эфиры,: то из них сначала нужно высвободить холестерин; Это осуществляют путем омыления Водным раствором щелочи.

15 Пригодной системой для .выявления образовавшейся при окислении холестерина перекиси водорода является система, содержащая пероксидазу, буферный раствор, окислительные индикаторы. Из пероксидаз предпочтительны пероксидаза хрена, а также лектопероксидаза. В качестве буферных растворов применяют распространенные фосфатные, цитратные или боратные с рН от 4 до 9, преимущественно от 5 до 8. Окислительннми индикаторами служат производные бензидина, например,о-толидин, о-ваиилин, К реагентам можно добавлять распространенные агенты иабухания — алгинат.натрия, карбоксиметилцеллюлозу, а также стабилизаторы для ферментов, например дитиэритрий.

Пример 1. 0,05. л сыворотки крови вводят в 10 мл 0,5 н.буферного раствора фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,4 вес; % гидроксиполиэтоксидодекана.

Экстинкцию (Е,) считывают при 240 нм в соответствующем спектральном фотометре, а реакция начинается с добавления 0,02 мл (0,1U) стабильной при хранении, освобожденной от следов смачивателя холестериноксидазы в 1 М растворе сульфата аммония. Через 3 мин экстинкцию (Е ) считывают снова.

Концентрацию образовавшегося свободного

46 колестерина и общего холестерина определяют из разницы между первым и вторым считыванием с учетом молекулярного коэффициента экстинкции для холестерина при 240 нм (1с,5 см /моль). Измерение типичной пробы дает 62 мг % свободного холестерина и

4 167 мг % общего холестерина (после омыления). При сравнительном анализе без добав- ления поверхностно-активного вещества продол. жительность реакции составляет 15 мин. Уда.ление следов смачивателя для улучшения стабильности хранения фермента осуществляют .при помощи гидрофобных адсорбирующих смол.

Пример 2. 0,05 мл сыворотки крови вводят в 10 мл 0,5 н.буферного раствора фосфата калия (pH 7,5), содержащего 0,2 вес. % гидроксияолиэтоксидодекана и 0,03 вес. % дезоИ . ксихолата натрия. Экстинкция (Е>) . считывается при 240 нм на спектральном фотометре, и реакция начинается с добавления - 0,02 мл .(0,1U) стабильной ври хранении, освобожденной от следов смачивателя холестериноксидазы в 1 М растворе сульфата аммония. Через

3 мин экстинкцию (Е ) снова считывают.

613731.5

5

Концентрацию образовавшегося свободиого холестерина и общего холестерина определяют аналогично примеру 1. Измерение типичной пробы дает 65 мг % свободного холестерина и 170 мг % общего холестерина (после омыления).

Пример 3. 0,05 мл сыворотки крови вводят в 10 мл 0,5 н.буферного раствора фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,2 вес. % гидроксиполиэтоксидодекана и 0,1 вес. % вторичного сульфата алкила. Экстинкция (5,) считывается при 240 нм в спектральном фотометре, и реакция начинается с добавления

0,02 мл (0,1U) стабильной при хранении, освобожденной от следов смачнвателя холестериноксидазы в 1 M растворе сульфата аммония. Через 3 мин экстинкцию (Е2) снова считывают. Концентрацию образовавшегося свободного холестерина и общего холестерина определяют аналогично примеру 1. Измерение типичной пробы дает 62 мг % свободного хо- лестерина и 167 мг % общего холестерийа (после омыления).

Пример 4. Фильтровальную бумагу пропи. тывают раствором следующего состава, мг/ 100 мл дистиллированной воды:

Цнтратный буфернйй раствор (1 М, рН 5,25) 20

Холестериноксидаза 100

Пероксидаза 50

Эту бумагу высушивают при 40 С и импрегнируют растворами по 0,2 г о-толидина в 100 мл хлористого метилена, каждый из которых, кроме того, содержит по r следую1цих поверхностно-активных веществ: полноксиэтилеитрибутилфеноловый эфир, яолиоксиэтиленсорбитанмонол аурат, полиоксиэтилениоиилфеноловый эфир, пол иоксиэтиленлауриловый эфир, поЛиоксиэтиленцетиловый эфир, иолиожснэтиленстеарат, полиоксиэтилеидодецилтио. Эфир.

После сушки получают бумагу- для тестов, которая окрашивается холестеринсодержащими сыворотками в зеленый цвет. Когда сы-. 4O ворочки одновременно содержат сложный хо. лестернновый эфир, то получают более. резкую зеленую окраску, если сыворотку до этого предварительно разбавляют одной каплей раствора холестеринэстеразы. Бумага для тестов, не содержащая поверхностно-активных веществ, ие реагирует с указанными сыворотками.

Пример 5. Фнльтровальную бумагу пропитывают раствором следующего состава, г/100 мл дистиллированной воды: 5Î

Цитратный буферный раствор (1 н., pH 7}. 20 (мл)

Холестериноксида за 0,10

Холестеринэстераза 0,25

Пероксидаза ., 0,05

Эту бумагу высушивают при 40 С и нмпрегннруют растворами по 0,2 r.î-толидина в 100 мл хлористого метилена, которые, кроме того, содержат каждый по 0,5 г следующих поверхностно-активных веществ: полиоксиэтиленкокоат. полирксиэтиленолеат, полиоксиэтиленполио прониленгликоль, полиоксиэтиленстеарила мин, полиоксиэтиленглицеринмонолаурат.

Г1осле сушки получают реактив для тестов, который, реагируя с сыворотками крови, окрашивается в зеленый цвет, если они содержат холестерин или сложный холестериновый эфир., Бумага для тестов без поверхностно-активных веществ не дает реакции на указанные сыворотки.

Пример 6. Предварительно импрегнированную бумагу по примеру 4 дополнительно импрегнируют растворами по 0,3 г о-толидина в

100 мл ацетона, содержащими по 1,5 г следующих поверхностно-активных веществ; диоктилеульфосукцинат натрия, натриевая соль додецилбензолсульфоновой кислоты, натриевая соль лаурилполигликольэфирсульфата, лаурил саркозинат натрия, лаурат натрия, холевая кислота, дезоксихолевая кислота, таурохолат натрия.

Этот реактив обладает такими же свойствами, как и реактив по примеру 4, но он доль. ше сохраняет стабильность красок реакции.

Пример 7. Предварительно импрегнированную бумагу по примеру 5 дополнительно импрегнируют растворами, содержащими по 0,4 г о-толидина и по 0,5 г следующих поверхностно-активных веществ: хлористый лаурилпнридин, хлористый бензетоний, хлорнстый цетилтриметиламмоний, 1-гидроксиэтил-1-карбоксим тил-2-алкил-имидазолинийбетаин. Свойст. ва этого реактива аналогичнь свойствам реактива по примеру 5.

Пример 8. Фильтровальную бумагу пропитывают раствором следующего соста ва, г/100 мл дистиллированной воды:

Фосфатиый буферный раствор (1 и., pH 6) 25 (мл)

Холестериноксндаза 0,10

Пероксидаза О,05

Халевая кислота 1,00

Ацетон 10 (мл)

Згу бумагу высушивают прн 40 С и Дополнительно пропитывают растворами скислительных. индикаторов в 100 мл ацетона, Количество ичдикаторов, их химическая структура и нх реакц окраски с содержащими холестерин сыворотками приведены в таблице

Пример 9. Приготавливают смесь из следукицих комаонеитов г/50 мл воды:

Дисперсия поливинилпропионата

Алгинат натрия (1,85% в

0,5 молях фосфатного буферного раствора, рн 5,5) . 35,00

Холестериноксидаза 0.50

Пероксидаза - 0,25

Диоктнлсульфосукцинат натрия 1,00 о-Толидин (растворенный в 6 мл ацетона} 0,60

Эту смесь растягивают в пленку трлщиной -300 мм по мокрому или намазывают на .твердый носитель и высушивают при 35 С. Если - на пленку накапать кровь, содержащую холестерин, и стереть ее через несколько ми61373!

7 нут, то пленка окрасится в зеленый цвет различной глубины в зависимости от концентрации холестерииа. Если затем к этому препарату добавить еще 1,0 г холестеринэкстеразы, то получится пленка, при помощи которой можАзинобис-(N -етилбензотиазолонсулт :фонислота 6)-диаммониеваа соль

О«2

Фиолетово-синий

Фиолетовый

Бию-(И. -алиилиинолон»2)-азин (М -метилбензотиазолон -2)-Я етилиииолонК 2 1 о,а

Зеленовато синий (Й метилбензотиазолон 2)-1-фенил-3,4-диметилтриазолон-б-азин

Oi3

Формула изобретения

0,025 — 0,500

Реактив для ферментативного определения холестерина, содержащий холестериноксидазу, новерхностно-активное вещество и солевой буферный раствор, атли4агощийся тем, что, с целью ускорейия анализа, он содержит указанные компоненты в, следующих количествах: вес. %:

0,010 — 1,000

Остальное

Составнтель С. Малютина

Техред Q. Луговая Корректор И. Гокснч

Тнраж П!2 Поа нсное

Редактор H. Хубларова

Заказ 36М/Е

БНИИПИ Государственного комнтега Совета Мнннстров СССР по делам нзобретеннй н открытнй

I 13035, Москва, Ж -35, Раушская наб., д. 4l5

Фнлнал ППП «Патент», r. Ужгород, ул. Проектная, 4 оВаниллилиден- п ваниллоилпщ» разон

А ни обис-(М -алинлиинолон-2суд ьфокислота -6)-днам Монневаи соль но определить повышенное содержание сложных холестериновых эфиров.

Г1редлагаемый реактив для форментативного определения холестерина позволяет быстро проводить анализы.

Холестери ноксидаза

Поверхностно-активное вещество, преимущественно гидроксинолиэтоксидекан

Солевой буферный ди раствор, преимущественно 0.5 н.фосфорнокислый KBJlHH