Способ получения из чумных микробов препарата ингибитора дыхания, митохондрий, чувствительных к чуме животных
(19)SU(11)639278(13)A1(51) МПК 5 C12N1/00, A61K35/66(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 17.12.2012 - прекратил действиеПошлина:
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗ ЧУМНЫХ МИКРОБОВ ПРЕПАРАТА ИНГИБИТОРА ДЫХАНИЯ, МИТОХОНДРИЙ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К ЧУМЕ ЖИВОТНЫХ
Изобретение относится к области микробиологии и биохимии, преимущественно может быть использовано при изучении патогенетических свойств возбудителя чумы. Известен способ выделения из чумных микробов препаратов ингибитора дыхания митохондрий разной степени очистки и активности. В частности, известен способ, заключающийся в экстракции чумных микробов 0,25 н. трихлоруксусной кислотой, осаждении из экстракта активной фракции ацетоном или этанолом. Известен также способ выделения из чумных микробов ингибитора дыхания митохондрий и его очистки, заключающийся в том, что клетки чумного микроба выращивают на плотной питательной среде при 28оС, бактериальную массу экстрагируют 0,25 н. трихлоруксусной кислотой, экстракт подвергают гель-хроматографии на биогеле Р-200, раствор фракции, обладающей ингибирующей дыхание митохондрий активностью, подогревают на кипящей водяной бане, при этом выпадает мало растворимый в воде и растворах хлористого натрия осадок - это один из фрагментов ингибитора, другой фрагмент выделяют из надосадочной жидкости после ее осаждения до комнатной температуры и центрифугирования путем добавления едкого натра до рН 10,5. Оба фрагмента высоко активны в реакции подавления дыхания при использовании в качестве субстрата дыхания малат или альфа-кетоглутарата натрия, их химический состав представлен преимущественно протеином с примесью полисахарида и нуклеиновых кислот. Однако существующий способ приводит к значительной потере (до 50-60%) ингибитора в процессе гель-хроматографии через биогель Р-200. При нагревании же примерно половина ингибитора получается в трудно растворимой в водной среде форме, в результате снижается его специфическая активность в присутствии субстрата дыхания - сукцината натрия. Кроме того, становится затруднительным или невозможным исследование некоторых физико-химических параметров препарата- молекулярного веса, радиуса Стокса, электрофоретической подвижности и гомогенности и т.д. Нагревание фракции, содержащей ингибитор, очевидно, вызывает расщепление его молекулы по меньшей мере на два фрагмента, вызывая тем самым искусственное изменение характеристики его молекулы. Так, в частности, молекулярный вес непрогретого ингибитора 30000-35000, а молекулярный вес растворимого фрагмента ингибитора 10000-12000 дальтон. Целью изобретения является получение очищенного ингибитора дыхания митохондрий, хорошо растворимого в водной среде без расщепления на фрагменты, высокоактивного в пробах подавления дыхания митохондрий и с более высоким выходом по сравнению с известным. Цель достигается тем, что выделение ингибитора проводят подщелачиванием экстракта чумных микробов 0,5-1,0 н. NaOH до рН 10,0-10,5 с последующей многократной 0,5 промывкой полученного осадка при рН 10,0-10,5 и одновременном его центрифугировании, а окончательную очистку препарата проводят растворением осадка при рН 5,0-5,6 выделением его указанным выше образом. Предлагаемый способ исключает потери ингибитора при выделении и позволяет получать ингибитор целиком в растворимом в водной среде виде без расщепления на два фрагмента. Окончательная очистка препарата достигается его промыванием в осажденном состоянии при рН 10,0-10,5 и однократным переосаждением при кислом и щелочном рН. Для получения сравнительных данных проведено параллельное получение препаратов ингибитора по известному и предлагаемому способам. Из 260 г (сухой вес) клеток чумного микроба получен экстракт 0,24-0,26 н. трихлоруксусной кислотой. После диализа против воды и сгущения под током воздуха экстракт разделен на 6 равных частей; из 3 частей экстракта получено 3 серии ингибитора по известному способу, из 3 других частей - по предлагаемому. Препараты сравнивают по результатам исследования их химического состава, иммунохимической активности, диск-электрофоретической гомогенности, молекулярного веса, растворимости в водной среде (дистиллированная вода, растворы хлористого натрия, фосфатный буфер с рН 6,8-7,2 и т.д.), выхода и способности сохранять специфическую активность в течение года хранения в лиофилизированном состоянии. Препараты ингибитора в пробах подавления дыхания исследованы с митохондриями морских свинок (из печени), не чувствительных, как известно, к действию другого ингибитора дыхания митохондрий, получаемого из чумных микробов, "мышиного" токсина. В качестве субстрата дыхания использовали сукцинат натрия. Последнее сделано с целью сравнения активностей фрагмента ингибитора, выделяемого при нагревании по известному способу, с активностью остальных препаратов. Все данные подвергнуты статистической обработке согласно рекомендациям П.Ф.Рокицкого ("Биологическая статистика", Минск, 1973, с.24-107). Из данных, представленных в табл.1, видно, что препарат ингибитора, выделенный по предлагаемому способу, не отличается по уровню очистки от полисахарида и нуклеиновых кислот и по содержанию протеина от препаратов ингибитора, полученных по известному способу (Р = 0,01). В то же время предлагаемый препарат имеет более полный набор аминокислот, чем фрагмент ингибитора, выделенный при нагревании, и идентичен в этом отношении другому фрагменту ингибитора, полученного по известному способу. Все три препарата ингибитора в отличие от исходного экстракта иммунохимически неактивны, растворимые в водной среде препаpаты диск-электрофоретически гомогенны. Ингибитор, полученный по предлагаемому способу, более чем в 2 раза превосходит растворимый в воде фрагмент ингибитора по молекулярному весу (Р < 0,01), в 4 раза превосходит фрагмент, выделенный при нагревании, по специфической активности в присутствии сукцината натрия (в присутствии субстратов дыхания - малата и альфа-кетоглутарата натрия, специфическая активность всех препаратов ингибитора одинакова). Ингибитор, полученный по предлагаемому способу, имеет в 20-60 раз более высокую растворимость в водной среде, чем фрагмент, выделенный при нагревании, статистически достоверно превосходит в несколько раз (Р < 0,01) по выходу как каждый из фрагментов ингибитора, полученных по известному способу, как по отдельности (табл.2), так и в сумме (сумма равна 38,0
24,0 мг.%). На протяжении 1 года хранения препараты ингибитора не изменяют свою активность (табл.2).
Формула изобретения
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗ ЧУМНЫХ МИКРОБОВ ПРЕПАРАТА ИНГИБИТОРА ДЫХАНИЯ, МИТОХОНДРИЙ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К ЧУМЕ ЖИВОТНЫХ, включающий экстракцию бакмассы чумных микробов трихлоруксусной кислотой с последующим выделением из экстракта ингибитора дыхания митохондрий и очисткой его, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и выхода препарата, выделение его проводят подщелачиванием экстракта 0,5 - 1,0 N NaOH до pH 10,0 - 10,5 с последующей многократной промывкой полученного осадка при pH 10,0 - 10,5, а окончательную очистку осадка при pH 5,0 - 5,6 и выделением его указанным выше образом.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000
Извещение опубликовано: 27.12.2000
