Способ получения пре-мрнк из органов эукариот

 

i i) 639897

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

С01оз Советских

Социагистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (51) Ч Кл а

С 07Н 21 j00 (22) Заявлено 19.11.76 (21) 2421712, 23-04

Государственный комитет

СССР с присоединением заявки ¹! (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.12.78. Бюллетень ¹ 48 ! (45) Дата опубликования описания 30.12.78 (53) УДК 547.963.3 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

В. Я. Арион, Э. М. Бекман, Л. Б. Гребцова и Т. И. Титова (71) Заявитель

2-й Московский государственный ордена Ленина медицинский институт им. Н. И. Пирогова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕ-мРНК

ИЗ ОРГАНОВ ЭУКАРИОТ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения пре-мРНК и может использоваться для изучения биосинтеза информационной РНК, как в норме, так и при различных патологиях, при 5 действии фармакологических препаратов и других биологически активных веществ.

Известен способ получения пре-мРНК пз органов эукариот, включающий гомогепизацию в растворе хлористого натрия, до- 1о бавленпе фенола, нагревапие смеси до 50—

55 С, цсптрпфугпрование ее, последующее отделение пптерфазного слоя, который c) спендируют в растворе хлористого натрия, смешивают с фенолом. Смесь нагревают до 15

62 — 64 С, цснтрифугируют, отделяют водный слой, а иптерфазный слой повторно суспендпруют в смеси раствор хлористого натрия-фспол-додецилсульфат натрия, нагревают до 83 — 85 С, центрифугируют, от- 2о деляют водный слой.

Из полученных водных слоев о1деляют белковые примеси обработкой фенолом, додецилсульфатом натрия, хлороформом, цептрифугируют и образующиеся водные 2> слои обрабатывают этанолом (1J

Однако известный способ не пригоден для выделения пре-мРНК из клеток лпмфопдной ткани, так как РНК деградирует пз-за активации рпбонуклеаз, освобождающц..ся в процессе выделения.

Цель изобретения — р.сшпрснпс сырьевой базы путем создания универсального способа, пригодного для получения нсдеградирова ных прс-мРНК пз любых ор апов эукарпот, в том числе пз клеток органов лимфатической системы: селезенки, тпмуса, лимфатических узлов, увеличение выхода Ii качества целевого продукта и достижение полного молекулярного состава пре-м РН К.

Поставленная цель достигается гомогенпзацией ткани в присутствии 5 — 10% фикола, экстракцпей РНК с добавлением диэтплппрокарбоцата 0,2 — 0,3 об. %, пнактпвацпей оставшихся рпбонуклеаз с помощью дополнительной оораооткп диэтплпирокарбопатом на стадии удаления белковых примесей.

По предлагаемом1 способу получения пре-мРНК пз органов эукариот гомогенпзаIIHIo Tl llll e T B 1l c T oPe xë0Ðèñòîãî натрия в присутствии 5 — 10% фикола, добавляют фенол, нагревают до 50 — 55"С, центрифугируют ее, отделяют интерфазньш слой, который суспендпруют в растворе хлористого натрия в присутствии дпэтнлппрокарбоната (Д311) в концентрации от

639897

0,2 до 0,3 об. %, смешивают с фенолом.

Смесь нагревают до 62 — 64 С, центрифугируют, отделяют водный слой, а интерфазный слой повторно суспендируют в смеси раствора хлористого натрия-фепол-додецилсульфат натрия (ДДС вЂ” Na) в присутствии 0,2 — 0,3 оо. % ДЭП, нагревают до

83 — 85 (;, центрифугируют, отделяют водный слой, и из полученных при этом водных слоев, предварительно инактивируя оставшиеся рибонуклеазы с помощью ДЭП в концентрации 0,2 об. "/о, отделяют белковые примеси обработкой фенолом, ДДСNa, хлороформом, центрифугируют и образующиеся при этом водные слои обрабатывают этанолом.

Пример 1. Для получения пре-мРНК из селезенки мышей б г ткани гомогенизируют в 0,25 мл 0,14М раствора хлористого натрия, содержащего 10 /о фикола (рН

6,8 — 7,0). Гомогенизацию проводят при 2—

4 С в стеклянном гомогенизаторе со слабопритертым пестиком. K гомогенату добавляют 75 мл 0,14М раствора хлористого натрия, 100 мл охлажденного водонасыщен loro фенола (рН 6,2), встряхивают в течение

15 мин при 50 — 55"С, охлаждают до 12—

16"С и центрифугируют (15 мин, 5000, 4 С) .

Образуется 3 слоя. Верхний (водный) и нижний (фенольный) слои отбрасывают (фенольные слои отбрасывают и после каждого следующего центрифугирования) .

Отделенную интерфазу — белый, плотный слой — суспендируют в 50 мл 0,14М раствор а хлористого натрия, содержащего

0,2 мл 50 "/о-ного раствора ДЭП в этиловом спирте (конечная концентрация ДЭ11 составляет 0,2 об. "/о ) . Смесь встряхивают при 35 — 40 С в темноте, добавляют 50 мл фенола, инкубируют при "— 64"С, энергично встряхивая 15 мин, охлаждают до 12—

16 С и центрифугируют при указанных условиях. После центрифугирования водный слой, содержащий «стабильную» пре-мРНК и некоторое количество растворимых белков, подвергают депротеинизации. Интерфазу суспендируют в 50 мл 0,14М раствора хлористого натрия, содержащего 0,2 об. %

ДЭП и 0,7 /о ДДС-Na и добавляют 50 мл фенола. Смесь встряхивают 15 мин при

83 — 85 С и после центрифугирования отбирают водный слой, содержащий «лабильную» пре-мРНК.

Удаление из препаратов РНК рибонуклсаз и других белковых примесей (депротеинизацию) проводят следующим образом. К

55 водным фазам, содержащим «стабильную» и «лабильную» пре-м1 НК, добавляют

50О/о-ный спиртовой раствор ДЭП до конечной концентрации 0,2 об. и перемешивают 1 — 2 мин при 18 — 20 С. Затем прибавляют раствор ДДС-11 а до конечной концентрации 0,5О/о и 50 мл фенола. Смесь встряхивают 15 мин при 2 — 4 С, центрифугируют и отбирают верхний, водный, слой, который подвергают дальнейшей двухкратной депротеинизации последовательным добавлением 50 мл смеси фенол-хлороформ (1: 1) и 50 мл хлороформа.

Для получения натриевой соли пре-мРНК к водным слоям (после всех депротеинизаций) добавляют по 150 мл охлажденного этилового спирта и оставляют при минус

10 — 15 С для формирования осадка РНК.

Исследование полученных РНК показало, что они относятся к классу пре-мРНК и получены в недеградированном состоянии.

П р и м ер 2. Все процедуры проводят по примеру 1, FIQ при концентрации ДЭП—

0,3 об. /о. При этом получают РНК с характеристиками по примеру 1.

П р им ер 3. Все процедуры проводят по примеру 1, но для получения пре-мРНК берут б г печени мышей.

Исследование полученных РНК показывают, что они относятся к классу пре-мРНК и получены в недеградирова ком состоянии. 1 ак, исследование нуклеотидного состава показывает, что коэффициент специфичности, К=Г+Ц/А+У, для

РНК, выделенной при 63"-С (пре-мРНКвз ) равен 0,95+-0,05 (n=10, уровень значимости 95 /о), а для РНК, выделенной при 85 С (пре-мРНКзз ) — К=0,87+-0,07 (n=10, уровень значимости 95 /о).

П р и м ер 4. Все процедуры проводят по примеру 1, но для получения пре-мРНК берут б г лимфатических узлов мышей.

Анализ полученных фракций показал: коэффициент специфичности для пр е-м Р11К6з, К= 0,98 -0,08; для пре-м Р Н Кзз К=0,91+-0,07 (n = 10, ур овень значимости 95 /з).

Пример 5. Все процедуры проводят по примеру 1, но для получения пре-мР1-1К берут б г тимуса мышей.

Исследование полученных пре-мРНК показывает: для пре-мРНК6з К=0,95 0,05; для пре-м РНКзз К=0,89+-0,06.

Количественный выход пре-мРНК (из бг ткани) приведен в таблице.

639897

РНК на 1 г сырой ткани по способу Ь1КГ

Увеличение выхода, Фракция РНК

Ткань предлагаемый прототип

255 пре-м РНКазпре-м РНКза

180

10 2

Печень (мыши) 155

15 3

145 пре-м РНКаз:

210

4д= д

60""

Лимфатические узлы (крысы) 95

160

180 пре-м РНКаз, пре-м РНКза

60 8

100 10

35+5

50 7

Лимфатические узлы (мыши) 120

185

250

1II e-M РНКаз пре-м PHK„.

Тимус (крысы) 115

1 0

215

70 пре-м РНКаз пре-М РНК„

95 10

140 15

Селезенка (мыши) 170

Формула изобретения

Составитель Л. Никулина

Техред С. Антипенко

Корректоры: О. Тюрина и Е. Хмелева

Редактор А. Соловьева

Заказ 2210/15 Изд. 1х1з 769 Тираж 526 Подписное

1IПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )1(-35, Раушская нзб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2

Способ получения пре-мРНК из органов эукариот, включающий гомогенизацию в растворе хлористого натрия, добавление фе- 5 иола, нагревание смеси до 50 — 55 С, центрифугировацие ее, последующее отделение интерфазного слоя, который суспендируют в растворе хлористого натрия, смешивают с фенолом, смесь нагревают до 62 — 64 С, 10 центрифугируют, отделяют водный слой, а интерфазпый слой повторно суспендируют в смеси раствор хлористого натрия-фенолдодецилсульфат натрия, нагревают до 83—

85 С, цептрифугируют, отделяют водный 15 слой, и из полученных при этом водных слоев отделяют белковые примеси обработкой фсиолом, додсцилсульфатом натрия, хлороформом, цснтрифугируют и образующиеся при этом водныс слои обрабатыва- 20 ют этанолом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода, повышения качества, достижения полного молекулярного состава пре-мРНК и расширения сырьевой базы, гомогенизацию ведут в присутствии

5 — 10% фикола, суспендирование проводят в присутствии дпэтилпирокарбопата в концентрации от 0.2 lo 0,3 об. %, с дополнительной инактивацией оставшихся рибонуклеаз диэтилппрокар бои атом на стадии удаления белковых примесей.

Исто IIIIII(ll инфо1) х!11цие1, прииятыс во внимание при экспертизе

1. Лриои В. Я., Мантьева В. Л., Георгиев Г. П. «Раздслсппс метаболпстически стабильной и лаби..ьиой информационных

РНК ядер н ивот111.1х клеток, — «Молекулярная биология», 1, М 5, 1967, с. 689—

698.