1,3-дизамещенные 7н-пиридо-/2,3-с/карбазолы,обладающие свойствами флюорохромов

 

еауюм

О П И С А Й И Й

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Соаетскнх

Соцналнстнческнх

Республик (ц)ба8131 (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено 14.02.77 (21) 2452614/23-04 с пвисоелинением заявки № — (51) М. Клг

С 07 О 215/! 2

Государственный камктет

СССР оо делам нзобретеннй н открнтнй (23) Приоритет

Опубликовано 25.04.79. Бюллетень ¹ l5 (53) УДК 547.759..32 (088.8) Дата опубликования описания 25.04.79 (72) Авторы изобретения В. И. Летунов, Г. M. Ларинов, Н. H. Бердник, T. П. Шулятьева и В. В. Мисенжников (71) Заявитель

Читинский государственный педагогический институт нм. Н. Г. Чернышевского

{54) 1,3 — ДИЗАМЕЩЕННЫЕ 7Н вЂ” ПИРИДΠ— (2,3 — C) — КАРБАЗОЛЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ

СВОЙСТВАМИ ФЛЮОРОХРОМОВ

Изобретение относится к люминесцентным красителям, применяемым в гистохимических исследованиях, а именно к 1,3-дизамещенным

7Н-пиридо- (2,3-с) -карбазолам, позволяющим при гистохимических исследованиях клеток методом люминесцентной микроскопии обнаруживать структуры, содержащие полисахаридные компоненты, такие как нуклеиновые кислоты, клеточные мембраны, волокна соединительной ткани.

Аналогичным действием в гистохимических реакциях обладает акридиновый оранжевый (1).

Однако указанный краситель проявляет низкую специфичность к клеточным оболочкам и мембранам, а также способен выцветать прн неоднократном облучении ультрафиолетовым светом.

Целью изобретения является создание более специфичных люминесцентных красителей для люминесцентной микроскопии и расширение имеющегося арсенала люминесцентных красителей, большинство из которых до сих пор являются труднодоступными.

Предлагаются новые соединения, обладающие свойствами флюорохромов общей формулы где R — метил, фенил, и — нитрафенил, стирил, п-бромстирил, Х вЂ” 2-фтор, 4-бром, 4-хлор, 4-нитро, З-нитро, 4-фтор, З-фтор, З-хлор, 4-метокси, обладающих высокой специфичностью к кле. точным мембранам, отсутствием выцветания.

Данные соединения получают конденсацией арил иден-3- аминокарбазолов с метил кетонами: ацетоном, ацетофенолом, бензальацетоном, и-нитробензальацетоном, A-хлор, и-бромбензальацето. ном.

Этим способом синтезируя.r следующие 1,3дизамещенные 7Н-пирндо- (2,3-cl-карбаэолы (7Н»

65813!

-пиридо- (2,3-с) -карбаэол далее обозначен как х):

1-фенил-3- (и-нитрофенил) -х (l);

1-фенил-3-(л-нитрофенил)-х (2);

1-стирил-3- (и-нитрофенил)-х (3);

1-стирил-3- (м-нитрофенил)-х (4);

1-метил-3- (n-нитрофенил) -х (5);

1-метил-3- (и-нитрофенил) -х (6);

1,3-ди- (и-нитрофенил)-х (7);

1- метил-3- (n-фторфенил) -х (8);

1-метил-3- (м-фторфенил)-х (9);

1-метил-3- (n-хлорфенил)-х (10);

1-метил-3- (м-хлорфенил)-х (11);

1-метил-3- (n-бромфенил)-х (12);

1- метил-3- (n- метоксифенил) - х (13);

1-фенил-3- (n-хлорфенил) -х (14);

1-фенйл-3- (м-фторфенил)-х (15);

1-фенИл-3- (о-фторфенил)-х (16);

1- (n-бромстирнл) -3- (n-бромфенил) -х (17), Пример 1. 1-фенил-3- (и-ннтрофенил)-7Н-пиридо- (2,3-b (-карбазол.

1 г (0,0037 моль) и-нитробензилиден-3-аминокарбаэола помещают в колбу с обратным холодильником, приливают 4 мл диметилформамида, 0,5 г (0,0042 моль) ацетофенона, 4 капли концентрированной соляной кислоты и нагрева- ют при 80 С н течение 7 ч.

По окончании реакции добавляют 0,5 мл водо, ного аммиака и выдерживают при -10 C в течение суток. Отфильтровывают выпавшие кристаллы, промывают HB фильтре спиртом и получают

0,4 r вещества желтого цвета, разлагающегося выше 305 С, выход 32%.

Найдено, %: С 76,7; 76,85; Н 3,82; 3,9;

N 99 992.

Э У Э

С „Н >,О

Вычислено, %: С 77,0; Н 4,1; и 10,1.

Соединение 2 получают аналогично из л-нит. робензалиден-3-амипокарбазола и ацетофенона, выход 22%, т. пл. 294 — 295 С.

Пример 2. 1-Стирил- 3- (и-нитрофенил)-7Н- пи ридо- (2,3- с) -карбазол.

1 г (0,0037 моль) и-нитробензилиден-3-ами- нокарбазола помещают н колбу с обратным холодильником, добавляют 0,6 г (0,0041 моль) бензальацетона, приливают 15 мл изобутилоного спирта, 4 капли концентрированной соляной кислоты и нагревают при 80 С в течение 7 ч.

По окончании реакции в реакционную смесь при пинают 0,5 мл водного аммиака и оставляют при комнатной температуре на сутки. Вьшавшии осадок отфильтровывают на фильтре промывают водным ацетоном (1:1) и перекристаллизовывают из смеси этанол/дпоксан (2:1). Получают 0 24 r желтого вещества, плавящегося с разЭ о ложением при 300-301 С, выход 18%.

Найдено, %. C 78,5; 78,63; Н 4,15; 4,19;

И 9,33; 9,38.

С,9 4Рз%

Вычислено, %; С 78,8; Н 4,31; и 9,52.

Соединение 4 получают аналогично из м-нитробензилиден-3-аминокарбазола и бензальацетона, выход 16%, т. пл. 290 — 291 С.

Пример 3. 1-Метил-3- (n-нитрофенил)-7Н- пиридо- (2,3-c l - к арбазол.

1 г (0,0037 моль) и-нитробензилиден-3-аминокарбазола помещают в колбу с обратным холо® дильником, приливают 10 мл иэобутилового спирта и 4 мл ацетона, добавляют 4 капли концентрио ронанной соляной кислоты и нагревают при 80 С в течение 7 ч. По окончании реакции прибавляют 0,05 мл водного аммиака, 4 мл ацетона и оставляют на сутки при -10 С. Вьшанший осадок отфильтровывают, промывая толуолом. Получают

0,3 r зеленовато-желтого вещества, т. пл. 266—

267 С, выход 28%, Найдено, %. С 74,62, 74,7; Н 4,07; 4,11, М 11,6; 11,8.

Сна йэОг

Вычислено,%: С 74,9; Н 4,25; М 11,9.

Соединение б получают аналогично из м-нитробензилиден-3-аминокарбазола и ацетона, г,пл. 242 — 243 С, выход 22%.

Пример 4. 1,3-Ди- (и-нитрофенил)-7Н-пиридо- (2,3-с1-карбазол.

1 r (0,0037 моль) и-нитробензилиден-3-аминоЗО карбазола помещают в колбу с обратным холодильником, добавляют 0,65 r (0,0039 моль) и-нитроацетофенона, приливают 15 мл изобутилового спирта, 4 капли концентрированной соляной о кислоты и нагревают при 80 С в течение 6 ч. По окончании реакции к реакционной смеси прилива35 ют 0„5 мл водного аммиака и оставляют на сутки.

Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ацетоном и перекристаллиэовывают из смеси зтанол/диоксан (2:1). Получают 0,45 г орано жевого вещества; разлагающегося выше 340 С, 4О выход 35%.

Найдено, %: С 70,15, 70,22; Н 3,21, 3,28; и 12,05; 12,11.

Вычислено, %: С 70,4; Н 3,48; и 12,2.

Щ

П р н м е p S. 1-Метил-3- (л -хлорфенил)-7Н-пиридо- (2,3-с1 -карбаэол.

2 г м-хлорбензилиден-З-аминокарбазола, 4 мл ацетона, 4 мл диметнлформамида, 0,6 мл нитробензола и 1 мл концентрированной соляной кислоты помещают в колбу с обратным холодильниИ ком и нагревают на кипящей водянои бане в течение 7 ч. После охлаждения ньшавший осадок отфильтровывают, промывают на филыре спиртом и перекристаллиэовывают из смеси этанол/ бензол (1:2). Получают 0,6 г желтого вещества, Б о плавящегося при 199 — 200 С, выход 28%.

Найдено, %: С 7705: 77,23; Н 4,21 ; 4,26; и 7,9; 8,11. й2НВС 1 Е

658131

Вычислено, %:С 77,25; H 4,39, N 8,2.

Соединения 8,9,10,12 и 13 получиот аналогично. Соединение 8 плавится при 192 — 193 С, выход 41%, соединение 9 — при 190 — 191 С, выход 37%, соединение 10 — при 235 — 236 С, выход

36%, соединение 12 — при 229 — 230 С, выход

41%, соединение 13 — при 230--231, выход 29%, Пример б, 1-фенил.3-(n-хлорфенил)-7Н-пиридо- (2,3-с) -карбазол.

1 r n-хлорбензилиден-3-аминокарбазола, 0,7 мл 1ц ацетофенона, 2 мл этилового спирта, 0,4 мл нит1 ,робензола и 0,4 мл концентрированной соляной кислоты запаивают в ампулу и нагревают в течение

5 ч при 120 С. По окончании реакции ампулу вскрывают, добавляют 1 мл водного аммиака, смолистую часть отмывают спиртом, оставшуюся твердую часть перекристаллизовывают из этанола с бензолом (1:2). Получают 0,22 г желтоватого вещества, плавящегося при 253 — 254 С, выход

28%. 29

Найдено, %: С 79,98; 80,03; Н 4,0; 4,08;

N 6,71; 6,77.

С„Н„С(И, Вычислено, %: С 80,2; H 4,21; и 6,93.

Соединения 15,16 и 17 получают аналогично.

Соединения обладают большей специфичностью к структурам с полисахаридной составляющей, чем известнь1е флюорохромы, например акридиновый оранжевый. Более экономичны прп примеТаблица ких объектах

Предлагаемые 7Н-пир

- (2,3-с) -карбазолы ердце сс езснка

1 оранжевые

Характер и локализацпя люминесценции аналогичны сое. дииениям 1, 2 и 3, цвет. люминесценции желтый

7 1,3-ви- (n-нитрофенил)-х

Характер и локализация люминесценции аналогичны соединениям 1 — б, цвет люминесценции оранжево-красный

Оранжевое ядЖелтозеленые оболочТо же

Желт Желтозеле- зелеЖелтозелеОранжевое свеченне лифоидных клеро, желто-зеленые оболочки ные ные ные ки, оранжевые клетки вол волок на обо, лочки

4 ! на нуклеотиды ток

Характер и локалнзашвг люминесценции аналогичны соединению 1

1 1-Фенин-3- (n-нитрофенил

2 1-Стирил-3- (n-нитрофе

3, 1-Метил-3-(n-нитрофен

4 1-Феиил-3- (лкштрофенил) -х

5 1-Стирил-3- (м-нитрофенил) -х

6 1-Метил-3- (м-нитрофенил) -х

8 1- Фенил-3- (n-хлорфенил) - х

9 1-Фенил-3- (м-фторфенил)-х пении, так KHK могут применяться в очспь разбавленнь х растворах (до !:200000) .

Методика испытаний.

1<расящие растворы. Навеску каждого соединения растворяют в минимальном количестве диметилформамида и конечное разведение 1:

;25000 получают при помощи 0,1 н, соляной кислоты.

Бактериальные культуры выращивают на подходящих питательных средах 24 ч, готовят мазки на стеклах и фиксируют 45 мин этанолом.

Срезы иэ тканей внутренних органов человека готовят с использованием криостата. Срезы сразу фиксируют "î.ëîäíûì ац.етоно.м.,,промывают физиологическим раствором и; n" высушивая, обрабатывают исследуемым соегцпгеппем.

Окраску препаратов проводят во влажной камере 30 м1ы, что исключает подсыхание pBcт воров, Красители имеют слабокислую реакцща. Преддметные стекла 3 раза промывают холодным физиологическим раствором, помещают в глицерин с физиологическим раствором, сверху кладут покровные стекла и края парафинируют.

Микроскопию проводят с помощью люмипесцентного микроскопа ИЛ-1 в условиях обьппгой лабораторной диагностики (возбуждаю|цне лучи сине-фиолетовые, запирающий фильтр ЖС вЂ” 18).

Полученные результаты представлены в таблице.

658131

Про дол жение т абл ицы

Цвет люминесценции на биологических объектах печени почки сосуды легкие сердце сел ии клетки езенка

10 1- Фен ил-3- (n- фторфенил)-х

Люминесценция желто-зеленая, выявляются ядра клеток, мембр& ны и оболочки

1-Метил-3- (n -хлорфенил) -х

В биологических объектах наблюдается яркая оранжево-желтая люминесценция полисахаридных структур (стенки клеток, капсулы бактерий, ядра, волокна сосудов, соединительная ткань) ! 2 1-Метил-3- (n -бромфенил) -х

Желтая с зеленым оттенком на клеточных стенках, капсулах, соединительной ткани, ядра лимонно-желтые.

Люминесценция желто-зеленая, выявляются четко оболочки клеток, ядра с оранжевым оттенком, ярко светятся капсулы бактерий

I 3 1-Метил-3- (n-фторфенил) -х

14 1-Метил-3- {ть-метоксифенил) -х

Люминесценция оранжевая с кирпично-красным оттенком, хорошо выявляются в объектах нуклеиновые кислоты (ядра, нуклеотиды бактерий), стенки и капсулы бактерий, полисахариды (соединительная ткань) 15 1-Метил-3- 1аа-хлорфенил) -х

В биологических обьектах люминесцируют полисахаридные структуры желтым цветом

16 1-Метил-3- g-фторфенил) -х

Яркая желто-зеленая люминесценция полисахаридных структур в клетках (капсулы бактерий, клеточные стенки, соединительная ткань сосудов и друтих внутренних органов), нуклеиновые кислоты (ядро, нуклеотид) желто-оранжевые

17 1- (и-бромстирил) -3- (л -бромфенил) -x

Слабая желто-зеленая люминесценция стенок, оболочек, соединительной ткани. Свечение, возрастает в УФ-лучах без фиолетовых

Составитель И. Бочарова

Техред Н.Бабурка Корректор И. Стен

РедактоР 0 Кузнецова

Заказ I )82/3!

Тираж 512 Полдисное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР ло делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4

С д н

Формула изобретения

1. 3-Дизамещенные 7Н-пиридо- 12,3-с) -карбазо1ты общей формулы где Й вЂ” метил, фенил, п-нитрофенил, стирил, и- бромстирил;

Х вЂ” 2-фтор, 4-бром, 4-хлор, 4-нитро, 3-нитро, З-фтор, З-хлор, 4-фтор; 4-метокси, обладающие свойствами флюорохромов.

Источники информации, принятые во внима ние при экспертизе

1. Зубжицкий Ю. Н. Люминесцентная микроскопия, 1964.