Способ получения -рибулозо-1,5дифосфата

 

ОП ИОАН ИЕ -;667%8

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВКДВТВЛЬСТВУ

Союз Советских

Соцмалкстнческих

Республик (61) Дополнительное к авт. саид-ву г (5l) М. Кл.

С 07 Я 7/02//

А 61 К 37/48 (22) Заявлено 01.09.76 (21) 2403060/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 15.06.7 9.Бюллетень № 22

Дата опубликования описания 18,06.79

Гесудерстеенва еетеетет

СССР ее делан «зебретее«« х етхрит«х (53) УДК 577.15*.07 (088.8) М. Э. Хага, П. Ч, Микельсаар, А. Э. Ляэне и А. А. Аавиксаар (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Институт кибернетики AH Зсгонской CCP (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ц- РИБУ ЛОЗО-1,5-П.ИФОСФАТА о

HgC-О-1

О

НС вЂ” ОН

HC — ОН

Hgd — Π— Р- 0 !

О

Д- Риф ТЮа-P— — Фи@аССВО:и

1 2

Изобретение относится к получению ор- менга является наличие достаточного коганических биологически активных вешеств лнчесгва 2 -рибулозо-1,5-.дифосфага. с помошью иммобилизованных ферментов. Получение и -рибулозо-1,5-дифосфага

Э Рибулозо-1,5-дифосфат занимает основывается на ферментагивном преврацентральное место в биосингезе органичес- шении 3 -рибоэо-5-фосфата в О -рибуло ких вешеств во всех зеленых растениях > зо-1,5-дифосфаг. Реакция прогекаег в две и в ряде микроорганизмов, являясь акцеп- =гадии с участием ферментов рибоэофосфатором углекислоты в цикле Кальвина, Со- гизомераэы (3 -рибоэо-5-фосфаг-кетолответствуюшую реакцию катализует фер- -иэомераза КФ 5.3,1.6 ) и фосфорибулокит мент рибулозо-дифосфат карбоксилаза (КФ назы (АТФТД-рибулоэо 5-фосфаг-1-фосфат

4.1.1.39). Предпосылкой всестороннего тв грансфераза КФ 2.7.1.19) по следующей изучения механизма действия этого фер- схеме

Нф,й Hg4- OM ! l

R4 — ОК

РаЕВВвф«СВРа Нб — OK щизеиериюа В ЮН д д „

ВТ, Р м оиаза

+ АТФ

Ке б-O- 0 age- е- Ф- ет

6 О д» Раееее-3- раев тт Я РТТТХУТМΠ—,Т- ф@ететРл т

667558

Известен способ получения O pHI5óïî=-. эо1,5 дифосфата, имеющий промьнцленное значение fl) По "òîìó способу целевой продукт получают ферментативно из

-рибозо5-фосфата и аденозин-5 -трифос-. фага (АТФ) с применением в качестве биокатализатора бесклеточного экстракта тионовых бактерий ThiobaciКus SSR . По=лучение целевого продукта по этому способу предусматривае проведение трех ос- о новных стадий: получение ферментных препаратов рибс . зофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы, синтез 3 -рибулозо-l,5-дифосфата ферментным путем из 2 -рибозо-5-фосфата и АТФ в атмосфере инертного газа, предпочтительно при рН 7,5-7,8; выделение препарата D «рибулозо-1,5

-дифосфата обычно в виде бариевой сели и его очистка. 20

Недостатком этого способа является применение в качестве ферментного катализатора водорастворимого бесклеточного экстракта тионовых бактерий. Водораство римый бесклеточный экстракт тионовых бактерий можно применять только однократно. В ходе выделения и очистки 33 -рибулозо-1,5-дифосфата из реакционной смеси ферменты бесклеточного экстракта инактивируются необратимо, Б ro же время выращивание бактерий и выделение бесклеточного экстракта являются наиболее трудоемкими этапами при получении 9 -рибуулозо-1,5-дифосфата.

Целью изобретения является упрощение способа получения Э-рибулозо-1,5-дифосфата и повышение выхода целевого про пук та, указанная цель достигается тем, что

pg белки бесклеточного экстракта связывают на пористом стекле, активированном фос геном и полученный иммобилизованный ферментный препарат используется много кратно.

Согласно изобретению описывается спо ф соб получения 2 -рибулозо-l,5дифосфата путем взаимодействия 2 -рибозо5 фосфата и АТФ в атмосфере инертногс газа с использованием в качестве биока$Q тализатора бесклеточного экстракта штамма Thioba&Иus 58K (Институт микро биологии АН СССР), иммобилизованного на пористом стекле, активированном фос геном.

С

Процесс обычно проводят в атмосфере аргона прп рН среды 8,4-8,6.

Применяемый катализатор можно использовать многократно.

Предпочтительно процесс проводят сле= дующим образом, Исходное сырье." получают иммобилизованные экстракты тионовых бактерий посредством связывания их с пористым стек" лом, активированным при помощи последо=вательной обработки - -аминопропилтри= этоксисиланом и фосгеном (изоцианатное стекло). Ьелки бесклеточного экстракта (10 мг/мл) связывают с активированным изоцианатными группами стеклом (0.,5 г/мл) в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,6-7,8) в течение 15-20 ч на холоду. Препарат отмывают от несвязанных белков 1Мраст= вором N aC5.

Целевой продукт готовят следующим образом.

Готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты (указаны конечные концентрации), ммоль: MgC62 27; цистеин 6,6; 13 -рибозо5-фосфат 27;

АТФ 27. рН раствора доводят до 8,48,6 с помощью 2 н. ИаОН. Прибавляют к смеси иммобилизованный ферментный препарат (33 г на 1 л), Реакцию прово дят в атмосфере аргона, отсутствие угле кислого газа в системе является необходимым условием, при комнатной темпера туре, рН раствора поддерживают при 8,4

8,6 титрованием 2,0 н. раствором NaQH.

Продолжительность реакции 2-3 ч. Жидкую фазу отделяют посредством декантирования. Стекло отмывают водой. Основной раствор и промывные воды объединяют, затем проводят частичную очистку целе= вого продукта и выделяют обычно в виде бариевой соли известным методом.

Технико-экономическая эффективность от использования предлагаемого способа для получения В -рибулозо 1,5-дифосфата выражается в обеспечении по сравне йию с существующими способами следующих преимуществ: в связи с многократ ным применением биокатализатора умень=шаются расходы на выращивание микроор-. ханизмов и выделение ферментного нре парата, применение твердого биокатализа тора позволяет увеличить выход D -рибулозо 1,5-дифосфата -в 1,8 раз по сравне нию с растворимым ферментным препаратом.

Пример. Исходное сырье: 10 г пористого стекла обрабатывают в течение

30 ч 5%ным раствором -аминопропил= триэтоксисилана в абсолютном толуоле (lOO мл) при температуре кипения раст вора. После охлаждения стекло промыва ют толуолом и обрабатывают в течение

2 ч 0,25 М раствором фосгена в абсолют

Анализ препарата на содержание шелочнолабильного фосфора показывает, что пре парат содержит 75% Э -рибулоэо 1,5-дифосфата.

Проверку способности препарата акцеп тировать углекислоту проводят с 14С ме ченным бикарбонатом натрия .в присутст» вяи гомогената высших растений. Резуль

5 ном толуоле (20 мл) при температуре кипения толуола. В ходе обработки аминогруппы на поверхности стекла переходят в изоцианатные. Полученное изоцианатное стекло высушивают в вакууме при температуре ниже 100 С, о

Клетки тионовых бактерий ТИ оьос Ию5

58R (штамм выделен в Институте микро.биологии АН СССР) разрушают озвучива» нием суспензии микробов в десятикратном 10 количестве 0,1 N фосфатного буфера (рН 7,6) при О С в аппарате УЗУН-1 У

4.2 при частоте 22 кГц в течение 10мин, Оболочки клеток осаждают центрифугированием при 20000$ в течение 40 мин.

Связывание белков бесклеточного эк6-: тракта тионовых бактерий проводят в О, 1 М

Фосфатном буфере (рН 7,6-7,8), 10 r активированного изоцианатными группами стекла суспендируют в 20 мл раствора, содержашего 10 мг белка в 1 мл.

Полученную суспенэию вакуумируют для удаления воздуха иэ пор стекла и ос» тавляют в холодильнике (4ОС) на 15

20 ч при постоянном перемешивании.По25 лученный препарат промывают 1 л 1,ON расТаора ИаСЕ. в колонке s течениеЗчи хранят в холодильнике (4 С) в 0,15 М раствора МаСЕ.

При составлении реакционной смеси

Зо для преврашения 2 -pm6o3 +xm+Ta в

9 -рибулозо 1,5-дифосфат эа основу была принята методика, предложенная для опре деленйя рибулокинаэы. NAACP.> 6Н20 (8 ммоль) - навеску 1,63 г растворяют в 20 мл воды. кистеня солянокислый (2 ммоль) - навеску 0,355 г растворяют в 10 мл воды, рибозо 5 фосфат бария ,переводят в натриевую соль. Иля этого !

8 ммоль рибозо-5 фосфата бария (навес40 ка 3,36 г. с учетом содержания в препа .рате 15% воды) растворяют в 40 мл ох

„лажденной до О С 0,1 н. соляной кисло те и добавляют 8 ммоль (1,136 г безвод ной соли) сульфата натрия. Осадок BaSOe

45 удаляют центрифугированием.

Аденозин 5 грифосфорная кислота, нат риевая соль (АТФ) 8 ммолъ навеску

5,07 г растворяют в 30 Ып воды..

В четырехгорлую колбу емкостью

500 мл, снабженную механической мешалкой, электродами рН-стата и трубками для введения газа и титруюшего раствора. заливают 150 мл бидистиллированной во» . ды, 20 мл раствора хлористого магния, 55

10 мл раствора цистеина, 40 мл раство ра рябово 5 фосфата натрия и 30мл раст» вора АТФ. Йобавлением 2,0 н. раствора

1Га )П при интенсивном перемешивании доводят рН раствора до 8,4-8,6. Прибавляют 10 r ферментного препарата и води до обшего объема 300 мл, Реакцию про одят в атмосфере аргона при комнатной температуре, рН растворе поддерживают при 8,4-8,6 титрованием

2,0 н. раствором М аОН. Продолжительность реакции 2-3 ч.

Жидкую фазу реакционной смеси отде» ляют от стекла текантированием. Стекло . промывают двумя порциями воды по 15 мл.

Основной раствор и промывные воды объединяют и наносят на колонку (З,ОхЗОсм) с сильноосновным анионитом Эолах- > в

СВ-форме со скоростью 100 мл/ч. Лдсорбированные вешества элюируют линейным градиентом соли и кислоты, составленным из 2,0 л бидистиллированной воды и 2,0 л

0,3 М HaCe + 0,03 М НСЕ пр скор ти 100 мл/ч. Э -Рибулоэо-l,5-аифосфат выходит из колонки сразу после АТФ.Разделение является неполным, фракции, содержашие 2 -рибулозо-1,5-дифосфат, объединяют, доводят рН раствора до 2,0 прибавлением 2,0 н. раствора НСЕ. При бавляют 15,0 r активированного медицин ского угля, предварительно промытого в колонке 1 H. НСЕ., а затем 10%-ной трихлоруксусной кислотой, и отмытого до нейтральной реакции. Жидкую фазу отде» ляют от угля фильтрованием, уголь много кратно (4 раз) промывают водой до

20 мл, каждый раз суспендируя уголь в воде. Промывные воды объединяют с основным раствором и доводят до рН 6,0 добавлением раствора М аОН.

Затем к раствору добавляют 15 мл

1,0 М раствора уксуснокислого бария и бариевую соль Э рибулозо-1.,5-дифссфа та осаждают добавлением 96%ного этанола до концентрации 30% (по объему).

Осадок отделяют центрифугироваиием, промывают 80%ным этанолом и высушива ют до постоянного веса в вакууме над

Р 05

Вес полученного продукта (2,95 г) соответствует выходу 50% от теоретического.

667558

Составитель 3;, 5очаров

Редактор Т. Йевятко Техред 3. Фанта Корректор М. Пожо

Заказ 3381/21 Тираж 512 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, ЖЗ5, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ЛПП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 таты определения радиоактивности свидс= тельствуют о высоком качестве полученного препарата как реактиваакцептора

СОр ю

Формула изобретения

1. Способ получения П:рибулоэс.-.1,5--дифосфата путем взаимодействия 2I -рибозо5-фосфата и аденозинтрифосфата в атмосфере инертного газа с использовани Io ем биокатализатора, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процес са и повышения выхода целевого продукта, в качестве биокатализатора применяют бесклеточный экстракт штамма Tbiobac Kus

58В (Институт микробиологии AH СССР), иммобилиэованный на пористом стекле, активированном фосгеном, 2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что процесс ведут при рН 8,4-8,6 в атмосфере аргона.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Авторское свидетельство СССР

%309610, кл.С 12 П 13/10, 30.11.71.