Способ замораживания беспозвоночных
! А":: „. -:сХН11 бнбпиатека leis
670781
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик (61) Дополнительное к авт. свпд-ву (22) Заявлено 01,08.77 (21) 2514411/30-15 с присоединением заявки № (23) Приоритет (5l) М. Кл.
F 25D 31/00
Государственный комитет (43) Опубликовано 30.06.79. Бюллетень № 24 (53) УДК 664.8.037.5 (088.8) по делам изобретений и открытий (45) Дата опубликования описания 30,06.79 (72) Авторы изобретения
Г. И. Соловьева и 3. С. Макаревская
Институт биологии Карельского филиала АН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
Изобретение касается замораживания биологических объектов для последующего их длительного хранения.
Замораживание различных биологических объектов, в том числе и беспозвоночных животных, например фитонематод, является основным способом замедления разрушения этих объектов в период их длительного хранения. Среди беспозвоночных, в частности нематод, известны виды, переносящие высыхание, а также и такие виды, которые содержат большой процент воды в тканях и в связи с этим нс способны к высыханию. Устойчивость этих видов нематод к замора>киванию различная. Установлено, что организмы, способные переносить высыхание, обладают повышенной устойчивостью к замораживанию, а следовательно, и повышенной выживаемостью в условиях длительного хранения при мипусовых температурах. Объясняется это тем, что организмы будучи высушенными находятся в состоянии анабиоза, проявления жизнедеятельности при этом у них сведены к минимуму либо отсутствует, поэтому замораживание не нарушает их функции; кроме того, ввиду отсутствия воды в тканях при охлаждении не образуется кристаллов льда ни вне, ни внутри клеток, т. е. отсутствует основной агент повреждения. В связи с этим для вышеуказанных организмов никакое замораживание не опасно.
Выживаемость организмов, не способнык
5 к обезвоживанию, является менес вероятной при замораживании. Гибель пк в это>л случае обусловлена образованием в тканяк
>кивотнык КрНсТВ.tëo льда, KQTopbIc Вызыва.от поврсждснис клеток и смерть организ1р ма. Те» нс мснес, у разнык видов нсматод наблюдалась выживаемость организмов прп замораживании пк во влажной среде в присутствии защптнык всществ, позволякпцпк блокировать вреднос действие крпсталлиза15 ции при разлпчнык скоростяк оклажденпя.
К таким веществам относятся углеводы, спирты, например глицерин. Благодаря защитному действию этик добавок стало возможным продолжительное кр IHeHIl|. прп
2р минусовых температурак нс только тканей и органов жпвотнык, крови, Но и разлпчнык живых объектов, например фптонсматод. Однако вышеуказанные защптныс агенты являются токсичными для жпвык объектов. Так, например, при обработке нематод глицерином необходимо предварительно провести его трехкратную дистилляцию в вакууме при температуре свышс
200 С с целью удаления такик врсднык примесей как окислы азота.
670781
H3PccTcII cnocoá 32 M0p25I
Способ осуществляют след. ющпм образом.
Нем атоды вида Ap hclcn 170 j cl es Ран 2 >ге 1lus, C2спог11а11с1>1!В н ТПГЬЯ(г!х многократIi0 промывают дистиллированной водой, а затем с iiotilott! t цснтрнфуп1рования проводят концснтрнрогапис нсматод до плотI:ости 10" червей 1:3 1 мл »1!татсльной срсдь!. ГQTot35»1 c c!!C1131!ю I!c«»3 log В,u:«IcT».1 сул фокснд 5 — 10%-ной концентрации и инкуб.:1руют ia водяно: бане при температуре 30 С в течение 30 мин. Затем 2/10 мл суспс:!зни нсматод в д;в!Стилсульфоксидс переносят В стскл 51н н ыe 3. «1пу л ы см кост1>10
1,2 мл;; запаива!От. Замораживая>ic »cg«, T в пластмассовом цнлгн!дрс с толщиной стспк 5 см и впутрсннн»» размерами 20Х
46 см. Б качестве охлаждающего агент", используют пары азота, Процесс заморажиВ2П11я проводя ст !1сн 13то. Сначал3 В прсдваритсс!ы!о о«лаждепный до — 5С цил;!ндр номсща от ампулы с псматодами н
Выдержи»а:от при вышеуказанной тсмпсраT«рс г> тс:сllllc 10 «!Ин. Затем тсм перaT";p > быстро сбрас t»aioi до — 22 С +-1 и удержи»ают На этом:ровне В Tcчспнс 10 мин.
HoccIc I и 11 ступени ампулы быстро io1 o«. жа;lи В ж1:дкий 2:>0:, Г,!с с, спсit:n»2 32-! !
«!ОРЯжнв!1,1 3СЬ (>«!«Г!Д!«ОСТЬ 32 МCP33 12) . BI>lдср)к!«а составляла от 1 до 3 ч, после 1 его объект мог «ра»11! cit при темпсратурс ж!>,1ИОГО азот!! (193 С) дО 6 «:cc. 1 !Ос;lс»»1дсржкн ампулы подогрева!от в водяной
i> 1н< нрн 38 С JIO тс«; I!op! nol 3 1:с растает
;1сд В 3!»!n«. 73х. Оттаявшгio к «льтуp г псре1 осят в соответствующуlо агаровую среду
IIIIID 62IJIII!. К I«3IIc oÉ оттаЯ»шей пуле добавляют 2 мл модифицированного раствора Гсллера. Выживаемость опрсдсл 5! ют liт . с;!1 oTc IcT3 1 исл 3 дв>и:к « нlихс51 Ilc .— мaTÎ;i p1i 40-I«pаT»0:! у»c7ttiict!uu. Устai>o»лспо, iTo криоза!пита была нанлу-!шсй с 10% -ной концентрацией дилитилсульфоКСНД;! Il В!>15!«Ива с:«!ОСТЬ УK332111I!>1«ВИДО»
Iu «l2тод как после 2 — 8 дней замораживанн51, так и при хранении и«в течение 5— б мсс. прн температуре 5кидкого азота осталañ» постоя!щой и составляла и среднем
-,.- n
Однако известный способ предполагает
3!!Птельпос «ранение объскта в условия« о
cr ep«tIII3I«1I«тсмпсратур (ниже — 160 С), что требует специального оборудования и использо»2!пня различны«дссрицитны«
:«ЛЯД-ЯГСНТОВ, НЯПРИМЕР, ТЯКИХ КЯК жИДКИй азот. Кроме того, известный способ замораживания носит частный характер, поскольку оп опробован на ограниченном числс видов п не исследована реакция (выживаемость) различных видов нсматод на разные концентрации протектора. Как показали исследования, для определенных видов
:1O
>15
>О
G0
65 нсматод диметилсульфоксид является токсичным. Например, при использовании известного способа замораживания на сапробнотнчсских нсматодах таких видов как
Cephalobus nanus u Cephalobus persegnis выживаемость составила не более 20%.
Следует также отметить, что подготовка объекта к замораживанию является более сложной и связана с определенными затратами времени н возможностью потери об ьекта нлн его повреждением.
Цс1! !о изобретения является повышение
Выживаемости видов сапробиотических нематод, например Cephalobus nanus и Cephalobus рс!зе и!3.
Поставленная цель достигается тем, что
» cuocooc за«!Ораживания беспозвоночных животных для последующего их длительного хранения I!pl. минусовых температурах, вкл.очающсм ступенчатое охлаждение с испо; ьзоваписм протектора, в качестве нос,!сдпсго используют водную среду Уайта, содср>кащу!о 1,2 — 1,6% агар-агара и охлаждение ведут по следующему режиму:
1 ступень: от 25 до 2 С со скоростью 0,03—
0,05 град/сск; II ступень: от 2 до 0 Ñ со скорсст1ло 0,013 — 0,016 град/сек; III ступсн »: от 0 до — 2 С со скоростью 0,006—
0,008 град/сек; 1Чступень: от — 2 до — 6,5 C со скорост1яо 0,0075 — 0,0095 град/сек.
Среда Уайта, содержащая водный солевой раствор и 1,2 — 1,6% агар-агара предстагляет собой плотный субстрат, в кото-!.o53 »о3а нро"но связана в гсль агар-агаром. 1Чинсра.!ьна5! основа понижает температуру переохлаждения среды без замерзания. Поэтому при охлаждении нематод на вышеуказанной среде до минуcoBbix температур не образуются кристаллы льда, по»рсждающие живые объекты.
Таким образом, водная среда Уайта, содержащая 1,2 — 1,6% агар-агара, является прот«ктором при замораживании нематод и
В сочстании с предлагаемыми ре кимами охлаждения обсспечиваст повышение их !
1ыжп»асмостн при минусовых температура«.
Пример 1. Двухнедельную чистую культуру нематод Cephalobus nanus, раз.;! ножа ю!цуюся в стерильных условиях на
Уайт-среде, в количестве 500 шт. помеIu3IoT в пластмассовые капсулы с водной средой Уайта, содержащей 1,3% агар-агара, н закрыва1от ватно-марлевыми пробками.
Ilсматоды выдсрживгют в капсулах 4 суток при 25 С I! относительной влажности 85%.
Замораживание, а в последующем и отогрев нсматод ведут в тех же пластмассовых капсулах в водной среде Уайта, содержащси 1,3% агар-агара. В качестве охлаждающего агента используют обычные микрохолодильники. Процесс замораживания ведут ступенчато по следующему режиму.
1 ступень: нематоды охлаждают от 25 до
2 С со скоростью 0,03 град/сек; II ступень:
670781
Формула изобретения
Составитель А. Макаров
Техред А. Камышникова
Редактор Н. Суханова
Корректор В. Петрова
Заказ 1303/18 Изд, М 408 Тираж 621 Подписное
I-1IIO Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
5 от 2 до 0 С со скоростью 0,013 град/сек;
I I I ступень: от 0 до — 2 С со скоростью
0,006 град/сек; IV ступень: от — 2 до 6,5 С со скоростью 0,006 град/сек. После этого объект хранится при 6,5 С в течение 8 мес.
Затем нематоды медленно отогревают при
18 — 20 С в течение 20 мин. Выживаемость определяли в отогретой среде по числу подвижных форм при 40-кратном увеличении.
Выживаемость нематод составила 92%.
Пример 2. Трехнедельную чистую культуру нематод Cephalobus persegnis, размножающуюся в стерильных условиях на
Уайт-среде, в количестве 500 шт. помещают в пластмассовые капсулы с водной средой Уайта, содсржащей 1,6% агар-агара, и закрывают ватно-марлевыми пробками. Нематоды выдерживают в капсулах в течение 4 суток при 25 С и относительной влажности 85%. Замора>кивание и отогрев нематод ведут в тех же пластмассовых капсулах в водной среде Уайта, содержащей
l,бо/о агар-агара. Процесс замораживания ведут ступенчато по следующему режиму.
1 ступень: нематоды охла>кда1от от 25 до
2 С со скоростью 0,05 град/сек; II ступень: от 2 до 0 С со скоростью 0,016 град/сек;
III ступень: от 0 до — 2 С со скоростью
0 008 град/сек; IV ступень: от — 2 до — 6,5 С со скоростью 0,0095 град/сек. После этого объект хранится при температуре — 6,5 С в течение 8 мес. Затем нематоды медленно отогревают при 18 — 20 С в течение 20 мин. Выживаемость определяли в отогретой среде по числу подвижных форм при 40-кратном увеличении. Выживаемость нематод составила 95%.
Использован:e предлагаемого способа замг оа>кивания обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества: повышает выживаемость живых биологических объектов, в частности, фитонематод до 92 — 95 /о при хранении их в условиях минусовых температур; не предусматривает использование токсических протекторов, таких как глицерин, диметилсульфоксид; не требует дополнительного оборудования и использования дефицитных
10 хладагентов, таких как жидкий азот; сокращение затрат рабочего времени на проведение процесса в 20 раз; исключает потери живого объекта и их повреждение.
Предлагаемый способ замораживания
15 может быть использован как для сохранения всех личиночных форм почвенных беспозвоночных, например фитонематод, клещей, так и в гистологических исследованиях для сохранения животных и растительных тканей с целью замедления процесса их разрушения.
Способ замора>киванпя беспозвоночных, преимущественно фитонематод, видов Cephalobus nanus u Cepha1obus persegnis, включающий ступенчатое охлаждение объектов в среде с криопротектором, отл и ч аю шийся тем, что, с целью повышения выживаемости фитонематод после замораживания, в качестве протектора используют среду Уайта, содержащую 1,2 — 1,6% агарагара, а охлаждение проводят от 25 до 2 С со скоростью 0,03 — 0,05 град/сек, от 2 до
0 С со скоростью 0,013 — 0,016 град/сек, от
0 до — 2 С со скоростью 0,006—
0,008 град/сек и от — 2 до — 6,5 С со скоростью 0,0075 вЂ,0095 град/сек.
