Модифицированный полимерами макропористый кремнезем в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белков и способ его получения

 

Союз Советских

Социалистических республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<11687081 (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено2401.77 (21) 2444832/23-05 с присоединением заявки Йо (23) Приоритет (51)М. Кл.2

С 08 F 8/32

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 2 5097 9. Бюллетень М 3 5

Дата опубликования описания 250979 (5З) УДК 543.544. .42 (088.8) А.В .Ильина,,В .И .Лозинский, Ю.A ..Давидович и C..В.Рогожин (72) Авторы изобретения

71) 3аявитель Ордена Ленина институт элементоорганических ( соединений AH CCCp (54 ) МОДИФИЦИРОВАНН61Я ПОЛИМЕРАМИ МАКРОПОРИСТ61Й

КРЕМНЕЗЕМ В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ

ДЛЯ ДИСУЛЬФИДНООБМЕННОЯ КОВАЛЕНТНОИ

ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ И СПОСОБ EZO ПОЛУЧЕНИЯ

-f cn — сн)- + - сн — сн3-„ с с с с

О Н О О N О

Ф - %; г! и — сн,сн сн сн снг -> - ©

20

N снг)> ннсо — сн,— з — я-©-, Изобретение относится к сорбентам, применяемым для выделения и очистки белков, а именно к носителю для дисульфиднообменной ковалентной хро-макропористый кремнезем с диаметром о пор 1100-1160 А, объемом пор 1,71,8 см /г, удельной поверхностью

30-40 м й/г, где М вЂ” звено винильного мономера, выбра н н ог о и з группы, сост оящей из

N-винилпирролидона, стирола, этилена и винилэтилового эфира, и способу получения такого носи- 25 тели.

Дисульфиднообменная ковалентная хроматография — недавно разработанный метод для тонкой .очистки белков и иммо били з ации ферментов . 30 матографии белков на основе модифицированного полимерами макропористогс кремнезема и его производных обшей форм улы

Известен модифицированный макропористый кремнезем, имеющий на поверхности группы. и способ его получения (1) .

Известный носитель для дисульфнднообменной ковале нт ной хроматографии на основе модифицированного химически макропористого кремнезема обладает недостаточно высокой эффективной емкостью по активньм к ди687081 группам (до 40 мкмолей на 1 г твердой фазы), а также некоторой (до

4-5 мг на 1 г твердой фазы) неспецифической сорбцией по белку, 5 что заставляет испольэовать буферные растворы с высокой концентрацией солей и хаотропных агентов, затруд-. няющих дальнейшую очистку белков.

Известный модифицированный макропористый кремнезем, получают обработкой -аминопропилированного макропористогo кремнезема 1-оксо-2-этокси-3-тиолан-5-ионом с последующим действием 2,2 -дипиридилди- 15 сульфидом. Однако этим способом получить производные макропористого кремнезема укаэанной общей формулы невозможно. Предлагаемый же способ позволяет решить эту задачу. 20

Цель изобретения — получение носителей для дисульфиднообменной ковалентной хроматографии с повышен3-1б- кратный избыток

CM СН СН НН

2 2 2 2+1 i i 1

С С С С

lrr sruti Р б ь

0 0 0 0 0 0

Иакропористый кремнезем; диаметр пор ПРΠ— ИбО А, обьем l,7 — И сиз/г, убельнае пабе рк ность

3д УО „г/г

-(СН вЂ” СН- М

i 1

С С

0 0

Ф

СН2СН2 СН2 — сн — сн — м+

С С

5-2Î-кратиьш избыток

Н2М вЂ” СН2-СН,-ж — CM — СН вЂ” М вЂ” CH — СН вЂ” M

I I 1

С С С С

Ф Ф

0 И 0 0 N 0

1 1

СН2СН2СИ2

СН СН2SM

+ -СН вЂ” СН+ - М1,- СН-СН+, 1 1 1

С С С С

iiir g Ф Г %

0 N 0 0

М

СН г СН2СН 2 СН2СНг >-> О

1.где М вЂ” звено винильного мономера, выбранного из группы, состоящей из

N сульфидному обмену -ч ной емкостью по активным к дисульфидному обмену группам и пониженной неспецифической сорбцией по белку.

В соответствии с предлагаемым изобретением носители укаэанной общей формулы получают ковалентным присоединением к поверхности макропористого кремнезема, модифицированного -аминопропилтриэтоксисиланом, сополимера малеинового ангидрида с вин иль ныл мономером с последующим введением тиольных групп и дальнейшей обработкой пслученноro материала дипиридилдисульфи— дом.

Предложенный способ отличается тем, что введение тиольных групп осуществляют путем обработки Э -аминопропилированного макропористого кремнезема 3-15-кратным избытком сополимера малеинового ангидрида с винильным мономером и затем 5-20-кратным избытком 2-меркаптоэтиламином или его .солью в присутствии основания . й-винилпирролидона, стирола, этиле1на и винилэтилового эфира; соотно687081

1аение ли; lI: р — 1:2-10:1. Продукт используют в качестве носителя дисульфиднообменной ковалентной хроматографии белков.

В примерах описывается получение и использование новых носителей для дисульфиднообменной ковалентной хроматографии белков.

Пример 1. Получение носителя модификацией макропористого кремнезема

<-ополимером малеиновогo ангидрида и

М-винилпирролидона (соотношениг ангидридных звеньев полимера и ам .ногрупп носителя 3:1) .

3,0 г (1,23 ммоля аминогрупп) аминоалкилированного макропористого кремнезема прибавляют, к раствору

0,77 г (3,69 ммоля ангидридных звеньев) сополимера малеинового ангидрида и винилпирролидона (соот— ношение мономеров 1:1; мол.вес. 60007000) в б мл сухого диметилформамида и перемешивают реакционную массу 3 ч при 50-60 C.. Жидкую Фазу отделяют декантацией и промывают носитель диметилформамидом до тех пор, пока показатели преломления чистого растворителя и промывок не станут одинаковыми. Затем носитель промывают ацетоном (3x20 мл), эфиром (Зх 20 мл) и сушат вакууме над Р2 О . Кислотно-основное титровачие ангидрйдных звеньев, привитых к твердой фазе, дает 0,14 ммоля на 1 r твердой фазы. ЙК вЂ спек модифицированного носителя (таблетка измельченного в порошок вещества в

КВч) показывает появление по сравнению З5 с аминоалкилпрованным кремнеземом полос при 1860 и 1780 см, свойст-1 венных насыщенным ангидридам с пятичленным циклом.

3,0 г полученного материала сус- 4Q пендируют в 8 мл раствора 2,8 г гидротартрата 2-меркаптоэтиламина в пиридине и перемешивают 3 ч при комнатной температуре. Далее носитель промывают пиридином (Зх20 мл), 0,1 н. ИС6 (Зх20 мл), дистиллированной водой (4x50 мл), ацетом (4x30 мл), диметилформамидом (3x20 мл) и суспендируют в 5 мл раствора 0,8 г 2,2

-дипиридилдисульфида в диметилформамиде, Перемешивают б ч при комнатной температуре, Жидкую фазу отделяют декантацией, а носитель промывают диметилформамидом (5x20 мл), абсолютным спиртом (5x20 мл) и сушат в вакуумоксикаторе над NarJA. Количество активных к дисульфидному обмену групп, определенное спектрофотометрированием выделившегося при исчерпывакщем восстановлении навески носителя

2-тиопиридона, составляет 80 мкмолей 60

N а ВЫтя) групп на i г т ерпоа Фазы.

f1 р и м е р 2, Получение носителя модификацией макропористого кремнеэе- 65 ма сополимером малги:-;ов01 3 ан гидри; и и NI-винилгирролидона (соотчов:ение ангидридных звеньев полимера и аминогрупп носителя 15:1) .

3,0 г (1,23 m«oJ;я амицогрупп) аминоалкилированногo макропористсгo кремнезема прибавляют r. раствору

3,85 r (18,45 ммоля ангидридных звеньев) сополимера малеинового ан— гидрида и N-винилпирролидона (соотношение мономеров 1:1у мол.вес.

8000-10000) в 1 5 мл сухогo пиметилФормамида и перемешивают реакционную массу 3 ч при 50-60 С. ",àëåå носи— тель промывают так же, как в примере 1, и сушат в вакууме над Р о

Кислотно-основное титрование ангидридных звеньев, привитык к твердой фазе, дает 0,18 ммоля на 1 г твердой фазы, ИК-спектр полученного продукта содержит полосы при 1860 и

1790 см, свсйственные насыщенным ангидридам с пятичленным циклом.

Затем 3,0 г полученного вещества обрабатывают как в примере 1, но гидротартрат 2-меркаптоэтиламина вводят в реакцию в количестве 14,0r а 2,2-дипиридилдисульфид в количестве 3,0 г. Емкость полученного

N носителя 110 мкмолей г пп — S— - S ó> ча 1 г твердой фазы

Пример 3, Получение носителя модификацией макропористого кремнезема ссполимером малеиновогo ангидрида и стирола

3,0 г (1,23 ламоля аминогрупп) аминоалкилированного макропористого кремнезема прибавляют к раствору

0,75 г (3 69 лмоля ангигридных .звеньев) сополимера малеиновогo ангидрида со стиролом (соотношение мономеров 1:1,5; мол.вес. 700011000) в диметилформа..лиде и перемешивают 3 ч при 60-70 С, Далее носитель промывают как в гримере 1 и сушат над Р „. Кис лотно-основное титрование ангидридных звеньев, привитьх к твердой фазе, дает 0,21 ммоля на 1 г твердой Фазы. )K-спектр получе: ного продукта содержит полосы при 1860 и 1790 см ", свойственные насыщенным ангидридам с пятичленным циклсл:. Далее 3,0 г полученного вещества суспендируют B 8 мл раствора

1,0 г 2-меркаптоэтиламина в диметилфоомамиде и перемешивают 3 ч при комнатной — åìïåðàòóðå, Затем íîcèòåëü промывают диметилформамидом (3x20 мл), спиртом (Зх20 мл), дистиллированной водой (3X20 мл), буферным раствором:

О, 1 М трис/НСС вЂ” 1 ммоль ЭДГ., р 8,0 (3x10 мл) и суспендируют в

5 мл укаэанного буфера. К суспензии добавляют 5 мл раствора 1,2 — 2,2 -дипиридилгисульфида в димe-.ил",ормамиде и перемешивают реакционную

687081 массу 6 ч при комнатной температуре, Жидкую фазу отделяют декантацией, а носитель промывают реакционным растворителем (100 мл), водой (200 мл) спиртом (100 мл) и сушат целевой продукт в вакуум-эксикаторе над МаОЛ. Емкость полученного ноN сителя 150 мкмолей групп на 1 г твердой фазы. 10

Пример 4. Получение носите-. ля модификацией макропористого кремнезема сополимером малеинового ангидрида с винилэтиловым эфиром.

3,0 r (1,23 ммоля аминогрупп) аминоалкилированного макропористого кремнезема суспендируют в 6 мл раствора 2,8 r сополимера малеинового ангидрида (6,15 ммолей ангидридных звеньев) с винилэтиловым эфиром (соотношение мономеров 1:5; мол.вес, 8000-12000) в диметилформамиде и перемешивают 3 ч при 50-60 С.

Далее носитель промывают как в приюере 1 и сушат над-Р О, Кислотноосновное титрование ангидридных

2 5 25 звеньев, привитых к твердой фаз е

1 дает 0,19 ммолей на 1 г твердой фазы. ИК-спектр полученного продукта содержит полосы при 1860 и 1790 см" свой ств ен ные насыщен ным ан гидридам с пятичленным циклом, Далее носитель обрабатывают как в примере 1, но гидротартрат ? -меркаптоэтиламина вводят в реакцию в количестве

4,67 г,а 2,2-дипиридилдисульфид

35 в количестве 1,0 r, Емкость полученного носителя 120 мкмолей

N групп на 1 г твердой фазы.

Пример 5. Получение носителя модификацией макропористого кремнезема сополимером малеинового. ангидрида с этиленом.

3,0 г (1,23 ммоля аминогрупп) аминоалкилированного макропористого кремнезема суспендируют в 10 мл раствора, 1,24 г (12,3 ммоля ангидридных звеньев) сополимера малеинового ангидрида с этиленом (соотношение мономеров 1:3; мол. вес. 1600-20000) в диметилформамиде и перемешивают 4 ч пии 60-70 С .

Далее носитель промывают как в примере 1 и сушат в вакууме над P O, . и Г

Кислотно-основное титрование ангидридных звеньев, привитых к твердой фазе, дает 0,24 ммоля на 1 r твердой фазы. ИК-спектр полученного продукта содержит полосы при 1860 и 1790 см ", свойственные насыщенным ангидридам с пятичленным циклом.

Затем носитель обрабатывают как в примере 1, но гидротартрат 2-меркаптоэтиламина вводят в реакцию в количестве 9,34 г, а 2,2 -дипиридилдисульфид в количестве 2,0 г. Емкость полученного носителя 190 мкмолей

Я

- -Я групп на 1 г твердой фазы, Пример 6. Выделение меркаптоальбумина из препарата бычьего сывороточного альбумина дисульфиднообменной ковалентной хроматографии.

200 мг бычьего сывороточного альбумина (CaIbiochem Ctrl ; 5A-титр 0,59 + 0,02 моля 53-групп на 1 моль препарата белка) растворяют в 10 мл буфера: 0,1 M Трис/ACE

0,3 KCt — 1 ммоль ЭДТА, рЛ 7,9 и вводят в контакт с носителем для дисульфиднообменной ковалентной хроматографии, получение кот орогo описанс в примере 1, причем носитель берут в количестве, соответствующем не менее чем 100-кратному избытку

-Я- групп носителя к числу

3Н-групп белка. Суспензию перемешивают 6 ч при комнатной температуре, твердую фазу отделяют декантацией и промывают последовательно тем же буферсм (3x30 мл),1,5М КСР (ЗхЗО мл1 деионизованной водой (Зх30 мя), и окончательно исходным буфером (50 мл) . Далее носитель с иммобилизованным меркаптоальбумином переносят в хроматографическую колонку и смывают белок элюцией линейным градиент. 1 от 0 до 0,1М концентрации цистеина в исходном буФере. фракции, содержащие белок, объединяют и подвергают обессоливанию на колонке. с сефадекссм Г-25,. а затем высушивают целевой продукт лиофильно. Н-титр полученного белка: 1,00 + 0,02 мс,"; 5 -групп на

1 моль альбумина. Изоэлектрофокусирование этого продукта на колонке в градиенте плотности сахарозы в борно-боратном буфере с линейным градиентом концентрации маннита показывает наличие одной фракции с изоэлектрической точкой 5,30, в то время как исходный препарат белка содержит 4 фракции с изоэлектрическими точками: 4,86; 4,98;

5 14; 5 30.

Результаты экспер ментов по выделению меркапто льбумина из препарата бычьего сывороточного альбумина с помощью носителей для дисульфиднообменной ковалентной хроматографии, получение которых описано в примерах 2-5, приведены в таблице.

687081

Леспецифическая сорбция, глг б еЛка/г носиыхад

Pp— апмину, %

-,еля

200

106 90 1 0,8

108 81,5 0,8

87 73,6 2,3

93 83,0 1,1

103 87,4 1, 4

200

200

200

200

По номеру при«ера, где описано получение соответствующего но25 сителя;

+ ECA -бычий сывароточный альбумин. .Пример 7, Выделение суммарного белка пекарских дрожжей дисульфиднаобменной кавалентной хроматографией.

Пекарские дрожжи эаморажинают в дистиллированной воде и дезинтегрируют н процессе Хьюса. Дезинтеграт оттаивают, суспензию центрифугируют при 5000 об/мин, суперматант отбирают и лиофилизуют.

1, О г лиофили эона нног о сусперн ат анта (содержание общего белка по данным биуретовой реакции О, 404 г) раст- @ норяют в 30 мл рабочего буфера:

О, 1 M Ha-фосфат — О, 15 M Na-дадецилсульфат — 1 ммоль ЭДТА, рЛ 7,8. Раствор 15 мин продувают аргоном,добавляя для гашения пены 3-5 капель этанола, затем вносят 1,0 мя 2-меркаптоэтанола и инкубируют смесь 2 ч при комнатной температуре . Далее отделяют ниэкомолекулярные вещестна на колонке с сефадексом Г-25, уравновешенным рабочим буфером, а фракцию элюата, содержащую высокомолекулярные вещества, вводят в контакт с носителем для дисульфидноабменной ковалентной хроматографии, получение которого описано в примере 1, причем носитель берут в количестне

И иэ расчета 1 мкмоль групп твердой фазы на 1 мг елка в исходном деэ интеграте. Суспен зию перемешинают при комнатной температуре 6 ч, затем отделяют твердую фазу, промывают ее рабочим буфером (100 мл) и суспендируют в там еже буфере (20 мл), содержащем 1 мл

-меркаптаэтанела . Пере«с:;инаг:т 4 ч при ка«ватной температуре, о.,деля:гт твердую фазу декантацией, прог.а.на— ют ее рабочим буферам ()00 мл), а фильтрат и промывки объединяют и подвергают абессаливанию электродиалиэом. Выход суммарных белковых веществ пекарских дрожжей 0,3 г (79%), При исг.альзавании для выделения па описанной методике суглмарных белковых веществ пекарских дрожжей с помощью носителей, получение которых описано в примерах 2-5, получают аналогичные результаты. Неспецифической; сорбции белков не наблюдается, так как при«еняют буферный раствор, содержащий детергент

Na-додецил сульфат .

П p v. «e p 8. Регенерация носителей после испольэанания в процессах дисульфидноабмен ной ковалентной хра» мат аграфии.

3,0 г носителя (любага из описанных в примерах 1-5) после использования в хроматографическом процессе суспендируют в 20 мл буфера: 0,1 М Трис/ЛС6 — 0,2 М Ма -додецилсульфат — 1 ммоль ЭДТА, рЛ

7,8. Добавляют 2 мл 2-меркаптоэтанола и перемешивают 6 ч при комнатной температуре. Твердую фазу отделяют декантацией, промывают буфером (4x5О мл), деионизованной водой (4х50 мл), спиртом (Зх20 мл), диметилформамидом (Зх20 мл), а затем обрабатывают 2,2-дипиридилдисульфиг дом согласно методике примера 1.

Пример 9. Регенерация избытка 2,2-дипиридилдисульфида после активации . 5d-носителей.

Раствор, содержащий иэ быт очный 2, 2, 2-дипиридилдисульфид и выделившийся в результате реакции актинадации

5d-групп носителя (см. примеры 1-5 и 8) 2-тиопиридон, отделяют от твердой фазы и упаринают в вакууме досуха. остаток растворяют в о

15 мл метанола, охлажд ют до О С и при перемешивании прибавляют по каплям ЗОВ-ный водный раствор перекиси водорода до полного абесцнечивания реакционной массы. Перемешинание продолжают на холоду еще 30 мин, а затем выливают раствор в 300 мл ледяной воды, при этом выпадает белый осадок, который отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл ледяной воды и сушат в вакуум-эксикаторе над 8a0H. Продукт перекристаллизовывают из гексана; т.пл. 57-58 С (лит.т.пл. 58 C).

Полученные согласно предлагаемому изобретению носители сохраняют нсе положительные свойства носителей на неорганической основе, нключая меá87081

12 менее 1-2 мг на 1 r твердой фазы), Это дает возможность использовать йолученные носители для выделения и очистки индивидуальных белков, ферментов и белковых комплексов с боль5 шей по сравнению с прототипом эффективностью.

Формула изобретения

1. Модифицированный полимерами макропористый кремнезем общей формулы

В СН1- СН вЂ” CHg СНу — СН вЂ” $ — 5

I I

0 0 N 0

% Ф Г 1

С С С С

- CH — СН - -(М )-„+ CH — СН „ где e: п: р- 1:2 — 10:1;

 — макропористый кремнезем с диаметром пор 1100-1160 А, объе- 25 мом пор 1,7-1,8 см /г, удельной п ов ерхн ост ью 3 0-4 0 м /г;

М вЂ” остаток мономера — N-винилпирролидона, стирола, этилена, винилэтилового эфира, 30 в качестве носителя для дисульфидиообменной ковалентной хроматографии белков.

2. Способ получения соединения по п.1, путем введения на у-амино- 35 пропилированный макропористый кремнезем тиольных групп и дальнейшей активации этих групп дипиридилдисульфидом, отличающийся

Составитель A.Ïåðåâåðçeâà

Редактор Т.Загребельная Техред Л.Алферова Корректс Е,Папп

Заказ 5995/55 Тираж 58 5 Подписное

ЦЛИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г .Ужгород, ул.Проектная,4 ханическую прочность, устойчивость к в оздейств ию микроорганизмов, постоянство объема в различных жидких средах, и, кроме тor о обладают повышенной емкостью по активным к дисульфидному обмену группам, которая достигает 150-190 мкмолей на

1 г твердой фазы, что в 3-5 раз превышает максимальную емкость прототипа. Предложенные носители имеют в 2-3 раза меньшую по сравнению с прототипом неспецифическую сорбцию по белку в процессе дисульфиднообменной ковалентной хроматографии тем, что, с целью повышения емкости носителя по активным к дисульфидному обмену группам и снижения неспецифической сорбции белков, введение тиольных групп осуществляют. путем обработкии . ) -амин опропили ров анногo макропористого кремнезема 3-15-кратным избытком сополимера малеинозого ангидрида с винильным мо номером, а затем 5-20-кратным избытком 2-меркаптоэтиламином или егo солью в присутствии основания.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР р 540870, кл, С 07 F 7/18, 1975 (прототип) .