Способ получения межвидовых гибридных форм картофеля

 

ОП ИСАНИЕ рр

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ф

,, И ;,.(51)М. Кл 2 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 090L79 (21) 2710489/30-15 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 050580.. Бюллетень ¹ 17

Дата опубликования описанив 0505.80

А 01 Н 1/04

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений н открытий (53) УДК 631.52 (088. 8) (72) Авторы изобретения

А.А.Кучко и P Ã.Áóòåíêo

Украинский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЖБИДОВЬЕ ГИБРИДНЫХ ФОРМ

КАРТОФЕЛЯ

Изобретение относится к селекции .сельскохозяйственных растений, в частности картофеля.

Известны способы гибридизации соматических клеток, при которых для смешения изолированных протопластов используют различные культуральные среды, например, Линсмайера и

Скуга (1).

Однако применение этих сред не дает возможность получать растения картофеля.

Известен также способ, при котором получают соматические гибриды между Nicotiana gIauca u Nicotiana

Iangsdorfii путем использования простой сахароэно-минеральной среды без добавления экэогенных факторов.

Однако использование для селекции гибридных клеток среды без гормональных добавок перспективно для отбора тех комбинаций, которые характЕриэуются способностью к опухолеобразованию., что значительно сужает рамки получения соматических гибридов у других сельскохозяйственных раотений, в частности картофеля, так как не обнаружена до настоящего времени гормонеэависимость. При этом можно повторить только то, что уже получено половым путем.

Целью настоящего изобретения является устранение барьера несовместимости и ускорение получения межвидовых гибридных форм картофеля.

Цель достигается тем, что слияние протопластов производят с помощью полиэтиленгликоля с молекулярным весом 1500-2000 в концентрации

40-50Ъ; для отбора гибридного продукта используют модифицированную среду Мурасиге и Скуга применяют двухступенчатую систему индукции

15 марфогенеэа и технику ткани-няньки .

Способ осуществляют следующим образом.

20 Свежеиэолированные в стерильных условиях с помощью 3,5-4,0Ъ раствора фермента ксиланаза протопласты из культуры ткани одного вида картофеля, например SoIanum tubего25 dum L., сорта Приекульакий ранний (2п- 4х = 48) и с помощью 2,0-2,5Ъ раствора того же фермента протопласты иэ мезофилла листа другого вида картофеля, например SoIanum -сЬасоег— щ se Bitt. (2п = 2х = 24) в 0,3-0,4 М

731934 растворе D-маннита смешивают в соотношении 1: 1.

Суспенэию изолированных протоплас тов приведенных видов картофеля осаждают центрифугированием (70110 g в течение 3-4 мин) и ресуспендируют с помощью 0,16-0,17 М раствора Ca(NO ) до плотности 8 ° 10 -1106 прот/мл.

В стерильных условиях, например в миКробиологических боксах, помещают

3-4 капли смешанной суспензии изоли- )О

Ъ рованных протопластов двух видов картофеля на гладкое стекло, например .покровное стекло. Для уменьшения испарения покровное стекло предварительно помещают в закрытую посуду, на- )5 пример чашки Петри (60 - 11 мм). Через 3-5 мин (когда протопласты осядут) осторожно по краям добавляем 8-11 капель 40-50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярным весом 1500-2000.

По истечении 15-25 мин культивирования полиэтиленгликоль удаляют с помощью остроконечной пипетки, на-, пРимеР пастеровской пипетки, и суспензию осторожно промывают 1-2 раза

0,16-0,17 М раствором Ca(NOq)g и

1-2 раза жидкой культивационной средой, например Мурасиге-Скуга.

Отмытую суспензию протопластов заливают теплой модифицированной культивационной средой, например

Мурасиге-Скуга (макромикросоли, Fe — хелат — по М-С,  — 2,0 мг/л

В6 — 0,8 мг/л, 2,4 Д вЂ” 1,0 мг/л, А — нафтилуксусная кислота (НУК)

1,0 мг/л, 6 — бенэиламинопурин (БАП) — 1,0 мг/л, сахароза — 25 г/л, маннит — 0,32 М бактоагар Difco

0,4-0,6Ъ, РН 5,4-5,7%.

Посуду заклеивают пленкой, Йапри- 40 мер парафином, инкубируют во влажной камере при 24-26 С и 16-18-часовом фотопериоде (500-700 лк).

Схема селективного отбора гибридных продуктов основана на отсутствии 45 деления клеток одного из партнеров, например S.chacoense, и подавлеНии морфогенеза у другого партнера, например S.tubегоsum.

Во время инкубирования слившиеся гибридные протопласты образуют клеточ. ную стенку и в ходе делений дедифференцируются.

Полученную через 2-3 недели каллусную ткань величиной около 1 мм вместе с блоками агаровой среды

10 Х 5 мм вырезают и высаживают на ту ж .среду, но беэ д-маннита. Инку. бируют их во влажной камере при

24-26 С и 16-18-часовом фотопериоде о

1500-2000 лк 1-2 недели. бО

Сформировавшуюся каллусную ткань картофеля (размером 2-3 мм) пассажи руют на среду для морфогенеэа (минеральная основа среди Мурасиге-Скуга;

В(— 0,6 мг/л; мезоинозит — 100 мг/л; 65

БАП вЂ” 5, 0 мг/л; НУК 1 мг/л; сахаР >за — 2, 5 г/л, агар — 7 г/л; РН

5,6-5,8).

Для усиления процессов метаболиз— ма каллусной ткани применяют технику ткани-няньки . С этой целью рядом с полученной тканью помещают кусочки другой дифференцированной ткани каРтофеля, например сеянца

9718 с/70 (Украинский НИИ картофельного хозяйства).

После 1-2 недель культирования каллусную ткань переносят на ту же среду, но с уменьшенным количеством гормональных добавок (БАП вЂ” 0,3 мг/л, НУК вЂ” 0,1 мг/л), где зачаточные стеблевые почки через 3-4 недели разви ваются в стебельки.

Таким образом, полученные побеги картофеля отделяют от каллусной ткани и переносят для укоренения на среду, разработанную в лаборатории оздоровления Украинского НИИ картофельного хозяйства.

Размножают растения черенкованием

in vitro и пересаживают в почву уже гибридные растения межвидового проис— хождения.

Эффективность предлагаемого способа заключается в устранении барьера несовместимости между видами, в получении межвидовых гибридных форм сельскохозяйственных растений, в частности картофеля. Способ дает возможность получать гибридные комбинации, образование которых половым скрещиванием невозможно, а именно цибридные растения (имеют гибридную цитоплазму и ядро одного из партнеров). Кроме того, способ относительно простой и доступный, не нуждается в дорогостоящем и дефицитном оборудовании, ферментах и реактивах.

Формула изобретения

Способ получения межвидовых гибридных форм картофеля, включающий слияние изолированных протопластов и культивирование их на питательных средах, отличающийся тем, что, с целью устранения барьера несовместимости и ускорения получения межвидовых гибридных форм, изолированные протолласты перед слиянием обрабатывают раствором полиэтиленгликоля с молекулярным весом 15002000 в концентрации 40-50% в течение

15-25 мин при комнатной температуре, после чего промывают один-два раза

0,16-0,17 М раствором азотнокислого кальция, а после слияния, культивируют на модифицированной среде

Мурасиге-Скуга до образования каллуса, который пассажируют сначала на обогащенную фитогормонами среду

Мурасиге-Скуга с применением техники ткани-няньки,, а затем на ту же среду, но с меньшим количеством

73193ф

Составитель Л.Марченкова

Техред Ж.Кастелевич Корректор M Âигула

Редактор О.Иванова

Заказ 1578/2 Тираж 723 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.> д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 гормонов до появления гибридных побегов, которые пересаживают в почву и укореняют.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Linsmaier Е.М., Scoog F. PIant

PhysioIogy 18, 100-127, 1965 °

2. Патент США 9 3832801, кл. Д01 G 31/00, 1965. (прототип, 3 . Остапенко Д.П., Прокопчук H.Ã. плив складу поживного середовища яа роост рослин картопл1 in vitro.

Сб Картоплярство, Киев, 1978, В. 9 (методика).