Способ выявления поверхностного антигена гепатита в

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскни

Социалистических

Респубпнк

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 100478 (21) 2608149/28-13 (23) Приоритет — (32) 11. 04. 77 (51) М. Кл.

A 61 В 10/00

Государственный комитет

СССР но делам изобретении и открытий (31) 786207 (33) США (53) УДК Аб 16-0 7 (088. 8) Опубликовано 150580. Бюллетень № 18

Дата опубликования описания 20.05.80

Иностранцы

Ллойд Алан Шик и Стефен Кеннет Карпентр (CIIIA ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма Майлз Лабораториз, Инк (C1IlA) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА .ГЕПАТИТА В

Изобретение относится i< области медицины, а именно к диагностике заболеваний гепатитом В.

Известен способ выявления повер— ностного антигена гепатита В в иссле- S дуемой пробе сыворотки или плазмы путем определения разности радиоактивности сыворотки, содержащей специфические меченые антитела, до и после .ее контакта с фиксированным на инерт- 10 ном носителе антигеном гепатита В(11.

Однако известный способ недостаточно чувствителен.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа. IS

Эта цель достигается тем, что исследуемую пробу пропускают через ко-. лонку, заполненную анионообменным материалом в форме частиц, которые находятся в равновесном состоянии в жид- » кости при рН 5-8, промывают колонку при рН 5-8, затем. пропускают меченные радиоактивным иэотопом специфические антитела с заранее определенным уров нем радиоактивнбсти, инкубируют в те- 25 чение 0,5-18 ч при 4-50 С, затем ко- лонку промывают при рН 5-8 и опреде.ляют радиоактивность анионообменного материала или элюата из предыдущей стадии.

2

Предлагаемый способ используют для выявления поверхностного антигена гепатита В (НВ5) в жидких пробах, таких как пробы сыворотки или плазмы. В качестве адсорбентов для антигена гепа-. тита используют различные гидрофобные материалй, включая некоторые алкилзаt мещенные полимеры, такие как и> -аминоалкилэамещейные агары, однако предпочтительно использовать ионообменные материалы. Значение рН для антигена

НВ . находится в диапазоне 3,5-5, а для анти-НВ5. 8, предпочтительно рН равно 6-8.

В качестве адсорбента используют анионообменные вещества — диэтиламиноэтилзамещенные полимеры, в частности те, в которых содержатся полисахариды, например целлюлоза или декстран, в качестве основной цепи. В качестве адсорбента для антигена НВе можно испольэовать ДЕАЕ-целлюлозу.

В качестве адсорбента можно испольэовать катионообменный материал, такой как карбоксиметилцеллюлоэу, если значение рй меченого анти-HB изменеS но до значения, которое ниже аналогичного показателя для антигена НВ® .

Для выявления антигена НВ5 в сыворотке или плазме пробу вводят в колон735153 ку, содержащую анионообменное вещество в виде частиц, которые находятся в равновесном состоянии в буферной жидкости с рН 5-8, предпочтительно

6,5- 7,5. Затем через колонку пропускают буферную жидкость с рН 5-8, предпочтительно 6,5-7,5, чтобы удалить полностью антиген НВ, который не адсорбировался анионообменным вецест — " вом.

После этого вводят в анионообменный материал заранее определенный объем раствора, меченного радиоизотопом анти-НВ, имеющего определенный уровень радйоактивности.

Выдерживают раствор, меченный радиоиэотопом анти-НВ, в контакте с анионообменным материалом 30 мин—

18 ч, предпочтительно 1-3 ч при 4

50 С, предпочтительно 40-50 С.

Пропускают через колонку буферную жидкость с рН 5-8, предпочтительно

6,5-7,5, чтобы удалить почти полностью меченный радиоизотопом анти-НВ, которйй не сорбируется анионообмен ным вецеством за счет связи с адсорбированным антигеном НВ Измеряют радиоактивность анионообменного материала или элюата из предшествуюцей стадии и сравнивают радиоактивность, измеренную на предшествующей стадйи, с радиоактивностью, измеренной с использованием жидкой пробы, не содержацей значительного количества антигена НВ вместо сыворотки или плазмы.

В качестве буферных жидкостей ис.пользуют фосфатный буфер, барбитальный буфер, трис-(оксиметил);амилометановый буфер, 4-(2-оксиэтил)-1- пипера. зинэтанолсульфоновую кислоту (ГЭПЭС) и 1,4-пиперазин-бис-этансульфоновую кислоту (ПИПЭС).

Пример 1. Подготовка аналитической колонки.

" Колонки содержат 0,5 мл анионообменной смолы, ДЭАЭ-целлюлозы типа

DE-52, которую загружают в колонку . разМером 9,5 х 75 мм; йзготовленную из полиэтилена, между двумя пористыми полиэтиленовыми дисками. Колонку плотно закупоривают верхним колпаком и нижней крышкой после того, как она заполнена объемом 0,02И раствора смеси моноосновного фосфата натрия-двухосновного фосфата натрия, который выполняет функции буфера при рН 6,8.

Буферного раствора должно быть достаточно,. чтобы произошло насыцение смолы и, кроме того, чтобы в резервуаре был слой в 1 мм над уровнем смолы.

Методика анализа.

Снимают верхний колпак и колонку укрепляют на решетке со стоком.

В буфер, находящийся в резервуаре выше слоя ДЭАЭ-целлюлозной смолы, добавляют .200 мкл анализируемой пробы

Сыворотки или плазмы или отрицательного контрольного образца. Далее со40 Ниже приведен пример вычисления граничного гамма-излучения (имп/мин) для слоя смолы. Семь аналогичных отрицательных контрольных проб подвергают отдельно анализу и определяется количество (имп/мин) гамма- излучения, ис-

45 точником которо является,Аой o лы (пороговое значение имп/мин) для каждого образца.

Образец Пороговое значение, имп/мин

1459

1488

1398

1444

1543

1487

1 3.87

2

4

6

Общее

Среднее

10206

1 4 58

Стандартное отклонение

+ 54 .1458 + (4 х х 54) = 1678

Граничное значение

65 держимое колонны перемешивают, чтобы перемешать. образец и буфер, а затем смесь стекает при снятии нижнего кол-,,пака.

Слой смолы промывают двумя последовательными добавлениями 4 мл.0,02 М раствора фосфатного буфера (рН 6,8).

Когда жидкость из колонки полностью вытекает, сверху на слой смолы добав-. ляют 200 мкл J -анти-НВ (удельная активность мечеиого анти-НВз- 14

20 мкКи/мкг суммарная активность приблизительно 50.000 имп/мин). Радиоактивный препарат пропитывает смолу, после чего нижний колпак снова закрывают (анти-НВ, который используется вместе с антйгеном НВ, очицают в соответствии со способом Линга и Оверби и метят по методу хлорамина Т) .

Затем колонку инкубируют 2 ч при

45оС (анализ 2 ч 45 С) либо в течение

20 ночи при комнатной температуре 22С C.

Затем нижнюю крышку снимают и слой смолы промывают двумя последовательными добавлениями 4 мл 0,02 М фосфат- ного буферного раствора (рН 6,8).

25 Когда жидкость из колонки удаляется полностью, нижнюю крышку ставят на место и колонку помещают в гнездо счетчика гамма-излучения, такого, как счетчик Jammacord, при этом определяют радиоактивйбсть слоя смолы.

Проба считается положительной, если дает уровень радиоактивности, источником которой является слой смолы, превышающий (или дает уровень радиоактивности промывающей жидкости менее, чем) граничное значение, вычисляемое как среднее количество импульсов/мин гамма-излучения, источником которого является слой смолы.

735153

/ раствора карбамида в 0,02М фосфатном буферном растворе (рН 6|8).

В резервуар, содержащий смесь карбамид-буфер добавляют 200 мкл анализи-. руемой пробы сыворотки или плазмы или.

5 отрицательной контрольной пробыв Со держимое колонки перемешивают, чтобы смешать образец и.смесь буфер-карбамид, а затем ему дают возможность отстояться в течение 10 мий перед тем, как раствор слить, что осуществляется при снятии нижней крышки., После того как раствор сливается, повторяются стадии, описанные в примере 1.

ОбнаружЕние антигена НВ в сыворот-! 5 ке (эндогенным анти-НВ ) . Отрицательную контрольную сыворотку и обычную коммерческую сыворотку, содержащую низкие концентрации антигена HB и анти-НВ, подвергают анализу при йомо20 щи модифицированной методики со ста:дией инкубации 2 ч 45 С, методики

Qusria„, которая списана в предыдущем примере, и методики ОизаЬ"фирьи

Лабораториз Эбботт, Северный Чикаго.

25 Результаты приведены в таблице.

Ag/AB (объем объем

Ausria Ausab отноше- РИА, ние Р/N единиц дифи дик роб

107,4 Отрицательная

34654

43448

29902

9143

+30755

+30449.4,0

127,9

3,0

146,9

+26003

2,0

+ 5272

11,3

1,0

54 х 10 и

512 х 10

5337

+. 1438

+ 1808

Отрицательная

0,4

0,2

5707

512 х 10

Отрицательная

З515. 0,0

Пороговое значение (имп/мин) для пробы минус граничное значение.

Предлагаемый пример показывает, что можно обнаружить антиген НВ в присутствии эндогенного анти -НВ ..

Чтобы подтвердить присутствие антигена НВ в сыворотке, проводится ис следование на центрифуге. Пробу сыворотки, уравновешенную буферным раствором глицина (рН 2,0), обрабатывают сахарозным градиентом 5-20% (вес/вес).

Смесь подвергают разделению на цент" 60 .рифуге со скоростью 36000 об/мин 3 ч

Фракции, которые извлекают из нижней части пробирки, при исследовании .по методике Qusria > на антиген НВ были определены как положительные. Это. 45

Следовательно, если подвергаемая анализу проба дает пороговое значение, превышающее 1678 имп/мин,. то проба считается положительной на антиген НВз, Пример 2. Радиоиммунносорбционный анализ на поверхностный антиген гепатита В в форме его иммунного комплекса с антителом, Описывается методика обнаружения антигена НВ, присутствующего в пробе в комплексе в анти-НВ, т. е, в форме его иммунного комплекса. В соответст вии с предлагаемым способом можно производить анализ пробы сыворотки на антиген НВ, содержащей анти-НВ, а также производить анализ на антйген

НВЗ в форме его иммунного комплекса в соответствующих пробах.

KQRoHKH подготавливают к анализам в соответствии с примером 1.

Методика анализа. Нижняя крышка закрыта, а верхняя снята;. из резервуара сливают фосфатный буферный раствор, а на его место заливают 1 мп 8И подтверждает наличие антигена НВ в сыворотке и, ясно доказывает, что антиген НВэ после отделения от анти-НВ на центрйфуге обнаруживается по методике Gusriaz> в то время, как он не бып обнаружен при помощи той же методики, когда находился в комплексе с анти-HB> .

Обнаружение антигена HB в форме его йммунного комплекса.

Приготавливают ряд проб для анализа добавлением возрастающих объемов положительной сыворотки антигена НВз к постоянному объему анти-НВз сыворотки человека с высоким титром.

735153,8

Окончательные объемы уравнивают нормальной сывороткой, отрицательной как на антиген HBg, так и на анти-НВ ..

После инкубации в течение 20 ч образовавшийся осадок удаляют на центрифуге, а образовавшийся верхний слой используют в качестве анализируемой пробы.

Каждая полученная таким образом проба анализируется по методике РИ-Ad, причем инкубацию осуществляют в течение

2 ч при 45оС, по методике Gusria >, а также по методике Qusab. Результаты приведены в таблице. Ag/As означает отношение объема положительной на антиген НЬ сыворотки, добавляемой к объему положительной на айти- НВ4 сыворотки.

По модифицированной методике РИ-Ad антиген НВ обнаруЖивается вГйрИсутствии анти-НВ при самой низкой кбйПентрации добавляемого антигена НВ (бтношение Ag/As — 0,2).

В пробах, в которых анти-НВ присутствует в избытке (Ag/Àâ Й 0,4) "; по методике Clusriaz> не удается обнару-— жить присутствие антигена HB+. С другой стороны, наличие анти-HB подтверждается в пробах, имеющих отношения Ag/As меньшие или равное 1,0 по методике ОиэаЬ; однако по методике

Clusab не удается обнаружить анти-НВ в присутствии избытка антигена НВ (Ag/As ) 2,0).

tI р и м е р .3. Исследование адсорбционных свойств различных анионо, обменных вещестВ для aHTHreHa НВ.

В диапазоне рН 5-8 исследовалась способность адсорбировать. антиген HB. слЬдующих анионообменных веществ:

ДЭАЭ-целлюлоза, тип ДЕ-52, ДЭАЭ-Яер—

hade x i 6) ДŠ— ЬерИасЪех ДЭАЭ- 8 ioge l ".

Объем 200 мл 3-НВз антигена (25 мг/мл) добавляют в каждую иэ нескольких колонок,. содержащих различ- ные айионообменнйе "вещества при различных известных значениях рН. Далее каждую колонку промывают двумя объемами по 4 мл фосфатного буфера с соответствующими значениями рН. Затем определяют радиоактивность колонокпри :помощи счетчика гамма-излучения.

Для каждой иэ исследованных смол оптимальная адсорбция наблюдалась при значениях рН 6,0-6,5. ДЭАЭ-целлюлоза, ДЭАЭ- pphadex u QAE-Sephadex имбйт весьма, сходное максимальное "средство адсорбции к антигену-НВ, тогда как

ДЭАЭ-Biog& А проявляет несколько более низкую способность к адсорбции ан тигена. При бслее широком исследовании было установлено, что ДЭАЭ-целлюлоза является предпочтительной смолой для применения в колонках,.так как не создает значительного сопротив ления потоку через колонку и обладает мнйимальной тенденцией адсорбировать

:) -анти-НВэ.

Пример 4. Радиоиммунносорбционный анализ (РИ-Ad) на поверхностный антиген гепатита В.

Описывается методика РИ-Ad для об наружения антигена НВ, отличающаяся тем, что стадия промывки между стадией загрузки пробы и стадией добавле.— ния меченого анти-НВз, исключена.

Каждый образец анализируют по методике РИ-Ad -2 ч 45 С с использованием

О другой серии з-анти-НВ .

Пример 5. Использование гидрофобных адсорбентов в радиоиммунносорбционном (РИ-Ad) анализа на поверхностный антиген гепатита В.

Исследуют ряд с9-аминоалкилзамещенных агароз в качестве адсорбентов в соответствии с методикой РИ-Ad. Подготовка колонок и методика выполнения анализа описаны в примере 1, за исключением тоГо, что адсорбент ДЭАЭ-целлю20 лозу заменяют различнымн со -аминоалкилзамещенными агарами, а адсорбент промывают двумя последовательными добавлениями 2 мп смеси ттис.-оксиметиламинометан-хлоргидратный буфер и 0,5М

25 раствора хлорида натрия (рН 8,2). Две пробы сыворотки, одна отрицательная и одна пОложительная на антиген НВ, анализируют с использованием ряда колонок, причем каждая содержит одно из следующих веществ, имеющих общую формулу агароз-(СН ), -NHz, где n — 4- 10 чйслО атомов углерода в алкильной боковой цепи

Ю -Аминоалкилэамещенные агарозы имеющие алкильные боковые цепи, содержащие более четырех атомов углерода, более предпочтительны для выявления,... антигена НВ

40 Пример 6. .колонки подготавливают к анализу в соответствии с методикой примера 1.

Снймают верхний колпак и колонку помещают на дренажную решетку.

45 В буферный раствор, находящийся в резервуаре над слоем ДЭАЭ-целлюлозы, добавляют .200 мл положительной сыворотки на антиген-BBs. Содержимое колонки перемешивают, чтобы смешать об50 Разец и буфер, затем содержимое колонки сливают при снятии нижней крышки.

По<Фе того как содержимое колонки сливают, слой смолы промивают двумя последовательными порциями по 4 мл

0,02М раствора фосфатного буфера (рН 6,8) .

Далее на верхний диск наносят слой

200 мл анализируемой пробы или отрицательного контрольного образца, которому дают воэможность впитаться в слой смолы.

Нижнюю крышку устанавлйвают на месо то и колонку инкубируют 2 ч при 45 С.

Нижнюю крышку вновь снимают и сверху на слой смолы наносят слой 2000 мл

735153

Составитель С. Малютина Ред"ктор Е. Корина Техред A.Ùåïàíñêàÿ Корректор M. Пожо

Заказ 2108/57 Тираж 673 . Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

"в Э-анти-НВ, и ему дают возможность впитаться в слой смолы. Йижнюю крышку снова эахрывают и колонку инкубируют еще 2 ч при 45 С. .Нижнюю крыаку снова снимают и слой смолы провывают двумя последовательными порциями по 4 мп 0,02М раствора фосфатного буфера (рН 6,8) °

Когда содержимое колонки полностью стечет, нижнюю крыаку вновь закрывают и измеряют радиоактивность колонки при помощи счетчика гамма-излучения.

Предлагаемый способ является более чувствительным и позволяе быстро и точно выявить поверхностный антиген .гепатита В в исследуемой пробе. . Формула изобретения

Способ выявления поверхностного антигена гепатита В в исследуемой пробе сыворотки крови или плазма путем определения разности радиоактивности сыворотки, содержащей специфические меченые антитела, до и.после ее контакта, с фиксированным на инертном носителе антигеном гепатита В, о т л и ч а ю шийся тем, что, с .целью повышения чувствительности способа, исследуе5 "у" пр бу пропуск т через колонку заполненную анионообменным материалом в форме частиц, которые находятcs s равновесном состоянии в жидкости при рй 5 — 8, промывают колонку при рН

5-8, затем пропускают меченные радиоактивным изотопом специфические антитела с заранее определенным уровнем радиоактивности, инкубнруют в течение 0,5-18 ч при 4 — 50 С, затем колонку промывают при рН 5-8 и опреде15 ляют радиоактивность анионообменного материала или элюата из предыдущей стадии.

Источники информации, щ принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США Р 3938853, кл. 308-4, опублик. 1976.