Способ получения протеинов из яичного белка

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

<11, 745478 (61) Дополнительное к авт. свид-ву — (22) Заявлено 01.06 78 (21) 2623787/28-13 с присоединением заявки № (51) М. Кл.

А 23 J 1/08 (28) Приоритет—

Гооударстевнный комитет

СССР по делам изобретений н отнрытнй (53) УД К 637.443. (088.8) Опубликовано 07,07.80. Бюллетень № 25

Дата опубликования описания 07.07.80 (72) А вторы изобретения

А. Я. Степка и Т. Ф. Фридман (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ .ПРОТЕИНОВ

ИЗ ЯИЧНОГО БЕЛКА

Изобретение относится к комплексному получению протеинов из яичного белка, например лизоцима, овальбумина, овоглобулина, используемых как сырье для получения аминокислот в медицине, косметике, микробиологической и пищевой промышленности.

Известен способ получения протеинов иэ яичного белка путем последовательного осаждения содержащихся в нем фракций лнзоцима, овоглобулина, овальбумина с последующей их очисткой кристаллизацией (1) .

Однако недостатками известного способа являются низкая активность препарата лизоцима, недостаточная чистота овоглобулина и овальбумина, сложность и длительность процесса, связанная с многократностью перекристаллиэацией

15 и стадий Очистки. Целью изобретейия является повышение активности препарата лизоцима, чистоты овоглобулина и овальбумина, упрощение процесса получения протеинов и обеспечение высокого их выхода.

Поставленная цель достигается тем, что перед осаждением фракций яичный белок вьщер2 живают прн рН 4,8 — 5,3, температуре 17 — 22 в течение 48 — 72 ч, и отделяют выделившийся побочный белок — овомуцин, а последовательное осаждение фракций осуществляют из раствора, отделенного от осажденного овомуцина.

Предлагаемый способ обеспечивает активность лизоцима 25000 — 30000 ед/мг белка, чистоту овоглобулина — 100%, чистота овальбумина — 100 o, с высокими выходами и упрощение процесса.

Увеличение активности лизоцима достигается за счет того, что в процессе вьщерживания яичного белка при рН 4,8 — 5,3 и температуре

17 — 22 С в течение 48 — 72 ч происходит,активация исходного сырья, что приводит в итоге к разложению фермент-белкового комплекса и освобождения лиэоцима. .В исходном сырье лизоцим связан с другими белками, что ведет к обратимой потере его активности. В процессе вьщерживания исходного сырья происходит освобождение фермента от белка. Кислая среда рН 4,8 — 5,3 разрушает связь лизоцима с другими белками. Тем самым создаются условия для восстановления активностилизоцима, 745478

10

1S

S5

В процессе выдерживания яичного белка происходит. освобождение активного центра ли. зоцима, который в исходном сырье частично блокирован неактивной: частью фермента, так как фермент находится в виде агрегатов друг с другом.

Предлагаемое изобретение обеспечивает также получение овоглобулина и овальбумнна высокой чистоты вследствие того, что в процессе активации сырья происходит осаждение побочных белков, включая овомуцин. Переход овомуцина в твердую фазу способствует его удапению, Дальнейшему фракционированию падвер гают жидкую фазу, не содержащую примесей побочных белков, что повышает чистоту выделяемых протеинов.

Осаждение овомуцинов в процессе активации сырья одновременно обеспечивает упрощегпге процесса очистки, т.е. за счет сокращения количества перекристаллиэаций овоглобулина и овальбумина с 5-ти до 2-х раз и количество перекристаллизаций лизоцима с 3-х до 2-х раэ, Пример 1. K 60 л яичного белка при перемешивании добавляют 1н раствор соляной кислоты до значения рН 5,0.

Смесь оставляют при 20 С. Осаждается слизистый осадок, состоящий в основном из овомуцина, Кристаллизация лиэоциМа.

Через 72 ч осадок удаляют декантацией, а к жидкости при перемешивании добавляют

NaCI до получения 5%-ного раствора и раствор едкого натрия до рН 9,5. Перемешивание продолжают до полного растворения соли, К приготовленному раствору для кристаллизации лиэоцима прибавляют 10 — 25 мл суспензии кристаллов лизоцима и оставляют при 5 С.

Раствор каждый день 2 — 3 раза перемешивают. Кристаллизация лизоцима заканчивается . в течение 6 сут. Кристаллы лизоцима собирают центрнфугированием и перекристаллизовывают, а центрифугат используют для получений овоглобулина и овальбумина.

Осадок технического лизоцима растворяют в 3 л О,OS раствора уксусной кислоты, нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием и еще раз растворяют в 1 л 0,05 растворе уксусной кислоты и опять центрифугируют.

Осадок отбрасывают, а центрифугаты объединяют. К центрифугатам добавляют натрий хлористый из расчета, чтобы получить S%-ный раст вор и 1 н раствор едкого натрия до рН 9,5.

Раствор оставляют при 5 С и в течение 3 сут заканчивается перекристаллизация, Вьшавший осадок перекристаллнзовывают еще 1 раз как описано. Сырой осадок лизоцима после второй перекристаллизации собирают на путч-фильтре и высушивают лиофильно. Активность лизоцима 30 000 ед/мг, выход — 150 г. Затем к раствору яичного белка (объем около 60 л) 4 после отделения лизоцима при перемешивании постепенно добавляюТ насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 1:1,06. Образуется осадок, состоящий из овоглобулина. Суспензию оставляют при комнатной температуре на

24 ч. Осадок собирают центрифутированием и подвергают дальнейшей очистке для получения овоглобулина, а центрифугат используют для получения овальбумина, Осадок технического

-C овоглобулина растворяют в 2,0 л деминерализованной воды. К раствору добавляют при пе ремешивании 2,0 л насыщенного раствора сульфата аммония для переосаждения овоглобулина.

Суспенэию оставляют при комнатной температуре и через 6 — 12 ч центрифугируют. Полученный продукт растворяют и осаждают подобным же образом еще 2 раза, После трехкратного осаждения осадки овоглобулина растворяют в минимальном количестве воды, диализируют через целлофан против деминералнэованной воды

72 — 96 ч. Во время диализа образуется осадок овоглобулин, который собирают центрифугированием. Осадок растворяют в минимальном количестве 5 -ного раствора сульфата аммония.

25 Выход — 60 г овоглобулггна. Чистота — 100% по хроматографическим данным. К центрифугату после отделения овоглобулнна при перемешивании добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до тех пор, пока раствор не приобретает устойчивое помутнение. В этот момент прибавляют 0,2 н раствор серной кислоты до рН 5,1. Суспенэию оставляют при 20 С.

Кристаллизация овальбумина завершается в течение 24 — 48 ч, Кристаллы овальбумина собирают центрнфугированием. Жидкость отбрасывают, а осадок перекристаллизовывают. Кристаллы овальбумина растворяют в 5 л деминерализованной воды. К раствору добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (4;5 +

40 0,5 л) до тех пор, пока жидкость не приобретет интенсивную и устойчивую опалесценцию, в раствор вносят кристаллическую затравку и оставляют при 20 С, Через 48 ч кристаллизация заканчивается. Полученный продукт пе45 рекристаллизовывают таким же образом еще раэ. После перекристаллиэации овальбумин, растворяют в минимальном количестве воды и подвергают диализу через целлофан до отсутствия сульфата аммония. Обессоленный раствор овальбумина высушивают лиофильно. Выход—

650 г овальбумина. Чистота — 100% по хроматографическим данным, Пример 2, 60 л яичного белка вливают ! в стеклянный реактор. Активность лизоцима в исходном сырье 22000 ед/мл, К белку при перемешивании механической мешалкой медленно добавляют 3 н раствор соляной кислоты до рН 5,3..Смесь оставляют при 22 С на 48 ч.

В течение указанного времени активность лизоСоставитель М. Ларина

Редактор С. Тараненко Техред Ж.Кастелевич Корректор В. Синицкая

Заказ 4036/1 Тираж 569 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 74547 дима в яичном белке повышается до 48000 ед/мл и одновременно осаждаются побочные белки.

Осадок удаляют декантацией, а жидкую фазу используют для получения лиэоцима, овоглобулина и овальбумина, как описано в предыдущем примере. Выход лизоцима 155 r. АAкKт ив нHоeсeть лизоцима 26400 ед/мг белка. Выход овоглобулина — 62 г, Содержание основного вещества — 100%.

Выход овальбумина 700 г. .1О

Чистота препарата — хроматографически чис. тый.

Пример 3. До обработки яичного белка определяют активность лизоцима, которая соответствует 23500 ед/мл, !5

К 70 л яичного белка при леремешивании механической мешалкой добавляют 1 н раствор соляной кислоты до рН 4,8 и смесь оставляют при 18 С. Через несколько часов яичный белок мутнеет за счет осаждения побочных белков.

Через 72 ч осадок удаляют декантацией и отбрасывают, в жидкой фазе определяют активность лизоцима, которая равна 46500 ед/мл, Обработанный яичный белок при рН 4,8 и о

18 С в течение 72 ч используют в качестве сырья для получения лизоцима, овоглобулина и овальбумина по способу, изложенному в примере 1. Выход лизоцима 170 г или 75% от теоретического содержания. Активность лизоцима 28000 ед/мг белка, Выход овоглобулина 65 г.

Чистота овоглобулина — хроматографически чистый.

Выход овальбумина 800 г или 60% от теоретического содержания.

& 6

Чистота овальбумина — содержание основного вещества 100% по хроматографическим данным.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качество биохимпрепаратов: лизоцима, овоглобулина, овальбумина.

Активация сырья и отделение побочных белков обеспечивают увеличение активности лизоцима в 1,5 — 2 раза, повышение чистоты овоглобулина с 95 — 97% до 100% чистоты овальбумина с 95 — 98% до 100 o.

Формула изобретении

Способ получения протеинов иэ яичного белка путем последовательного осаждения содержащихся в нем фракций лизоцима, овоглобулина, овальбумииа с последующей их очисткой кристаллизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода указанных фракций, упрощения способа, урвышения активности лизоцима и чистоты овоглобулина и овальбумина, перед осаждением фракций яичный белок выдерживают при рН 4,& — 5,3, температуре

17 — 22 в течение 48 — 72 ч и отделяют выделившийся побочный белок — овомуцин, а последовательное осаждение фракций осуществляют иэ раствора, отделенного от осажденного овомуцина.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР N 247703, кл. А 23 J 1/08, 1968.