Способ получения спин-меченого производного аденозинтрифосфата

 

О П И С Н И,. Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (»)764326

Союз Советских

Социалистических

Ресщблик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 16.11.77 (21) 2538802/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 23.09.82. Бюллетень № 35 (45) Дата опубликования описания 23.09.82 (51) М. Кл.

С 07Н 19/16//

С 07G 7/02

Государственный комитет (53) УДК 631.811.98..07(088.8) ло делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

A. В. Ажаев, Р. И. Жданов, Э. Г. Розанцев, иностранцы

Штриккенбах Барбара и Курт P. Х. Репке (ГДР) Ордена Ленина Институт химической физики АН СССР и Научноисследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПИН-МЕЧЕНОГО

ПРОИЗВОДНОГО АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА

I ° о

Изобретение относится к органической химии, а именно к способу получения нового спин-меченого производного аденозннтрифосфата-2 (3 )-0-1 оксил-2,2,5,5-тетраметилпирролидин - 3-карбонил - аденозип- 5 трифосфата (1), который необходим для биохимических исследований, например для выяснения механизма действия ферментовв.

Спин-меченые производные биологически 1о активных соединений, в частности нуклеотидов, находят применение в биохимических исследованиях.

Известен способ получения немеченого

2 (3 ) -0-1-оксил — 2,2,5,5 — тетраметилпирро- 15 лин-3-карбонил-аденозинтрифосфата из

2,2,5,5-тетраметил-3-карбоксипорролан — 1оксила и N,N -карбонилдиимидазола с последующим взаимодействием с аденозинтрифосфатом (АТФ). Процесс проводят в 20 две стадии: 1 — получение и выделение

N-1-оксил-2,2,5,5 - тетраметил-пирролин-3карбонил-имидазола; 2 — модификация им

АТФ в ацетоне при нагревании. Выделение целевого продукта проводится методом бу- 25 мажной хроматографии в системе: изомасляная кислота — аммиак — вода (PH =

11) (l j

Недостатком способа является то, что процесс проводят в две стадии, а целевой ЗО продукт выделяют из реакционной смеси методом бумажной хроматографии, что черезвычайно трудоемко и позволяет получить лишь нез»ачптельные аналитические количества. Кроме того, продукт, получаемый данным способом, стабилен лишь в течение 2 — 3 недель.

Цель изобретения — разработка нового способа, позволяющего быстро и значительно проще выделять новый целевой продукт в препаративпом масштабе.

Поставленная цель достигается путеi получения спин-меченого производного аденозинтрифосфата общей формулы (I) заключающимся в том, что 1-оксил-2,2,5,5тетраметил-3-карбоксипирролидип в апротонном растворителе подвергают взаи;Ioдействию с N,N -карбонилдиимидазолом

764326

Формула изобретения

Способ получения спин-меченого произ15 водного аденозинтрифосфата 2

ОРОР ОРОСН, т

I I

-О -0-0 О

О

1l

НО 0-С вЂ”

Составитель Г. Коннова

Техред A. Камьииникова

Корректор А, Галахова

Редактор П. Горькова

Заказ 1142/12 Изд. У 222 Тираж 390 Подписное

Н110 «Г1оиск» Государствен! ого кохи!тета СССР по делам изобретений и открытий

113035, й1оск.:а,,71 .-37, Рау!нская иаб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

1lpll K0м;lа11!Ои I CMпсp 171 с С посл«,1 ".(.II!11 .! взаl!. 0 1е!!Сч!3пем 11олу 10!!1!010 !1х!11, 1азоль ного прои..вод!;ого с а;1.".нозипгрп, осфатом и выделе целевого продукта колопо 1ной хроматографией с использованием в 5 качестве адсорбспта спликагеля, 0!èl!101!íîI0 от органических веществ, а в качестве элюепта — системы и-бутанол: вода: уксусная кислота в соотношении 5: 3 . 2 соответственно. В качестве апротонного рас- 1О творителя обычно используют диметилформамид.

Пример. Получение 2 (3 ) -0- (1-оксил-2,2, 5,5 - тетраметилпирролидин - 3-карбопил)— аденозиптрифосфата (1).

К смеси 745 мг 1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-3-карбоксиперролидина (=4 ммоль) и

649 мг N,N -карбонилдимидазола (=4 ммоль) приливают 1,5 мл безводного диметилформамида (бурно выделяется 20 двуокись углерода). Через 30 мин к этому раствору имидазолида при комнатной температуре добавляют раствор 623 мг АТФ (1 ммоль) ди-Na-соль, 4Н20) в 1,5 мл воды. Через 45 мин темножелтую эмульсию 25 (сначала два слоя, через несколько мип образуется однородный вязкий раствор) разделяют на 4 порции в центрифужные пробирки и приливают по 5 мл ацетона в каждую пробирку. Выпавшие осадки цсптри- 30 фугируют 5 мин при 5000 оборотов в минуту, желтый раствор декантируют, а светложелтый осадок растворяют в 2 мл воды.

Выделение целевого продукта проводят колоночной хроматографией на силикагеле 35

0,05 — 0,2 мк фирмы «Merk», обработанном

2н. соляной кислотой (2 ч при кипении с последующей промывкой водой, системой н-бутанол: вода: уксусная кислота 7: 2: 1 и сушкой). Элюирование спин-меченого 40

АТФ (1) проводят системой и-бутанол: вода: уксусная кислота=5: 3: 2. Контроль фракций осуществляют спектрогротометрически и методом ЭПР.

Фракции элюируют диэтиловым эфиром 45 после добавления воды, водную фазу упаривают в вакууме и остаток лиофилизуют.

Получено 250 мл спин-меченого аденозинтрифосфата (I) (43 !о ): Rl 0,35 (Rl АТФ

0,20) целлюлоза, импрегнированная поли- 50 этиленимином 0,4 М КН2Р04 рН 3,5, Хмах

257 НМ (и- 14900), а>- 16,1 гс вода, отно..:с;,lc адепиц: фосфат= — 0,35: 1,0 (теор.

0;, 1 0)

1! редлагаемый способ позволяет полу ить целевой продукт (1) в одну стадию без нагревания в препаративном масштабе в 3 — 5 раз быстрсс, чем по известному способу получают аналоговые соединения. Получаемый продукт стабилен и может храниться при — 4 С в течение нескольких месяцев. отличающийся тем, что 1-оксил-2,2,5,5тетраметил-3-карбоксипирролидин в апротонном растворителе подвергают взаимодействию с N,N -карбонилдиимидазолом при комнатной температуре с последующим взаимодействием полученного имидазольного производного с аденозинтрифосфатом и выделением целевого продукта колоночной хроматографией с использованием в качестве адсорбента силикагеля, очищенного от органических веществ, а в качестве элюента — системы и-бутанол: вода: уксусная кислота в соотношении 5: 3: 2 соответственно.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве апротонного растворителя используют диметилформамид.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Петров А. И., Сухоруков Б. И. Спинмеченые пуклеозид-моно-, ди- и трифосфат. — «Биофизика», № 20, 1975, с. 965—

966.