Способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием

 

I,:,.

" r 1fTH0-Теурнц (6 цес ая I

:61иете .

ОП ИСАНЙЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистических

Республик

<1786855

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 161276 (21) 2428806/28-13 (23) Приоритет — (32) 18 ° 12.75 (31) 150114/1975 (33) Япония

Опубликовано 07.1280. Ьоллетень Hо. 45

Дата опубликования описания 0712,80 (51)М. Кл 3

А 61 К 35/70

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н открытий (53) УДК 612. 396. .11(088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Киро Асано, Цуеси Сайто, Хиромицу Танака, Сатору Эномото (Япония) Иностранная фирма

"Куреха Кагану Когио Кабусики Кайся" (Япония) (73) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ, ОБЛАДМОНИХ

ПРОТИВООНУХОЛЕВЫИ ДЕЙСТВИЕИ

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается получения противоопухолевых веществ.

Известен способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевьм действием, путем экстракции из грибов с последующей очисткой целевого продукта оТ балластных примесей f1 .

Однако известный способ не обес- 10 печивает высокой, противоопухолевой активности полисахаридов.

Целью изобретения является повышение противоопухолевой активности полисахаридов. 15

Эта цель достигается тем, что ,экстракции подвергают грибы Сог iolus, biformis, Corio lus conchiber,Coriolus

consor Coriolus hirsutus, Coriolus

yargamenus, Coriolus pubecens или 20

Coriolus versicoIor .çêñòðàêöèþ ведут. водой или разбавленным раствором щелочи при автоклавировании под давлением в течение 5-360 мин при 150200 С. 25

Кроме того, экстрагирование ведут под давлением 5-20 кг/смз.

А экстракцию ведут разбавленным раствором щелочи в концентрации ниже 1 н. 30

Способ осуществляют следующим образом.

Исходный материал, грибницу или плодовые тела базидиомицетов, принадлежащих к роду Coriolus, помещают в аппарат высокого давления, например автоклав периодического действия или типа проточноГо трубчатого экстрактора, вместе с водным растворителем и материал экстрагируют в нем при температуре от 120 до 200 С.

Давление, применяемое прн этой обработке, находится на уровне общего давления паров водного растворителя, загруженного в сосуд. Обычно оно не выше 20 кг/см., предпочтительно менее 16 кг/см, но должно быть не ниже 1,8 кг/см ° Время экстрагирования устанавливают от 5 до 360 мин.

Проходящее время .экстрагирования выбирают в соответствии с применяемой температурой, которая находится в области от 120 до 200оС. Если температура экстрагирования ниже 120 С, то не обеспечивается удовлетворительный эффект экстрагирования, а если температура йтревышает 200 С, то может быть разложение активной составной части. Если время экстрагированин меньше 5 мин, то эффект экстрагирова786855

$0

60 ния плохой, а период экстрагирования, превышающий 360 мин, может вызывать разложение активной составной части.

Операция экстрагирования может быть выполнена повторно при вышеупомянутых условиях, или исходный материал базидиомиценты) может быть погружен в водный растворитель при гемпературе ниже 100 С перед операцией экстрагирования, или полученный экстракт может быть промыт водным растворителем прй температуре ниже

100 С после экстрагирования. В качестве растворителя используют чистую воду, водный кислый или щелочной раствор, водный раствор мочевины и водный раствор аминокислоты. Наиболее предпочтительным водным растворителем является вода или разбавленный менее чем 1 н щелочной раствор.

Полученный таким образом экстракт затем очищают посредством ультра,фильтрации,высаливания,диалиэа,обрат ного осмоса или другими способами, которые могут применяться по отдельности или в сочетании, чтобы удалить вещества с низким молекулярным весом (вещества с молекулярным весом менее

5000) из экстракта.

Такая очистка позволяет получить азотсодержащий полисахарид с высокой противоопухолевой активностью, с вы- соким тормозящим действием против сплошного (SoI Ы) рака Саркома-180, не только при внутрибрюшинном введении, но также и при стоматическом введении мышам.

Полученные полисахариды эффективны не только для предотвращения побочных действий при химической терапии больных, пораженных опухолью и обнаруживающих повышение чувствительности к радиотерапии, но также повышают сопротивляемость против заражения вирусами или бактериями,,когда иммунитет или физическое состояние больного слабые, стоматическое введение полисахаридов улучшает деятельность печени, улучшает аппетит, излечивает желудочные расстройства, улучшает мочеиспускание и является эффективным при лечении лепры. Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Грибницу Сог(о)05

versicolor (Fr.) fuel, полученного искусственным разведением, высушивают до содержания воды 10% и делят на пять частей. Затем каждую часть смешивают с 12,5-кратным количеством (по весу) воды и загружают в автоклав, в котором проводят экстрагирование при условиях экстракции, показанных в табл. 1. Экстракт, полученный из каждой части, затем фильтруют, чтобы отделить раствор экстракта, и полученный раствор экстракта подвергают диализу при 72-часовом то. ке воды при 5 С, используя диализную

t0

И

ЛО

ЗО

40 трубку в соответствии с обычным методом. Эта диалитическая обработка устраняет из экстракта вещества с низким молекулярным весом (вещества с молекулярным весом менее 5000).

Диализованный раствор затем концентрируют, чтобы получить красно-коричневый порошок с содержанием воды около 7%. Этот порошкообразный материал имеет средний молекулярный вес более 10000. Результаты элементарного анализа и различные испытания на цветную реакцию, приведенные в табл. 2, доказывают, что это вещество представляет собой азотсодержащий полисахарид.

Из результатов приведенных выше испытаний видно, что полученные -продукты представляют собой полисахариды, содержащие первичный пептидносвязанный азот.

Для того, чтобы определить противоопухолевое действие азотсодержащих полисахаридов, полученных в соответствии с настоящим изобретением, проводят следующие испытания.

Опухолевые клетки Саркомы-180 пересаживают в брюшные полости мышей и через семь дней (после достаточного размножения клеток) 10 кусочков клеток пересаживают затем другой группе мышей в подкожную область подмышечной впадины для развития твердых опухолей. Внутрибрюшинное введение полисахаридов начинают через 24 ч после пересадки. Вещество вводят один раз в день через день в количестве 10 мг/кг за одно введение, в общем количестве 0,2 мл/20 г (живой вес мыши). На 25-ый день после пересадки удаляют опухоль каждой мыши и определяют ее вес. Тормозящее действие полисахаридов на рост опухолей вычисляют из среднего веса опухолей в группе мышей, которым вводили полисахариды, а среднего веса опухолей в контрольной группе.

Результаты измерений представлены в табл. 3. Подробности получения соответствующих образцов, использованных в этом опыта, т.е. количество использованного водного растворителя (воды), температура и время экстрагирования, степень экстрагирования, селективность и выход также показаны в табл. 3.

Из результатов, приведенных в табл. 3 видно, что в опытах, проведенных на мышах, которым были пересажены подкожно опухолевые клетки

Саркомы-180, каждый из аэотсодержащих полисахаридов, полученных в соответствии с этим изобретением, показывает равную или более высокуюпротивоопухолевую активность по сравнению с подобными препаратами, полученными при обычных условиях экстрагирования. Выход по отношению

786855

Таблица 1

Количество воды (в весовом отношении к грибу) Температура, С

Время мин

Селективность, %

Давление, кг/см

Степень экстрагирования, %

Выход по отношению к грибу, %

Содержа ние азо. та, %

Торможение по отношению к

Саркоме-180, %

Образец, 9

12,5

52,2 18,1 89,9

52,5 27,1 87,9

68,4 42,4 91,0

59,0 40,6 93,0

70,6 57,0 94,9

120 360 2,0 34,5

150 60 5,0 51,5

0,71

12,5

0,72

12 5 160 60 6 3 62 0

0,72

0,73

165 30 7,2 68,8

180 20 10 2 80,6

12,5

12,5

0,73

Образец для срав- . нения 12,5

0,71

47,9 10,4 89,8

98 360

21,6 е

При м е ч а н и е. Образец для сравнения представляет собой образец, полученный с использованием того же самого баэидиомицета, что и для образцов с 1 по 5 в соответствии с изобретением, но путем экстрагирования при нормальном давлении в соответствии с обычным методом.

Степень экстрагирования представляет собой степень .растворенного гриба, использованного в качестве исходного материала, которая выражена в вес.%.

Селективность представляет собой процентный выход аэотсодержащих полисахаридов с молекулярным весом свыше 10000, полученных из экстракта.

Выход по отношению к грибу представляет собой процентный выход аэотсодержащих полисахаридов с молекулярным весом свыше 10000 по отношению к общей загруз. ке гриба. к количеству использованного гриба заметно улучшается.

Пример 2. Грибницу; того же самого базидиомицета, который исполь зуют в примере 1, делят на восемь частей и каждую часть загружают в автоклав вместе с 12,5-кратным (по отношению к весу грибницы) количеством щелочного или по существу нейтрального водного раствора, описанного в табл. 3. Далее проводят экстрагирование в условиях давления и температуры, показанных в табл. 3.

После экстрагирования материал в автоклаве нейтрализуют и фильтруют, чтобы,отфракционировать раствор экстракта путем отделения от нерастворимых как остатка от экстракции. Этот раствор экстракта подвергают обработке методом диализа в соответствии с процедурой, описанной в римере 1, получая вещества со средним молеку- Щ лярным весом свыше 10000. Когда эти вещества проверяют на различные цветные реакции, представленные в табл. 2, подтверждается, что они представляют собой азотсодержащие полисахариды. Чтобы определить противоопухолевую активность полученных таким образом азотсодержащих полисахаридов, образцы с 1 по 8 этих веществ вводят мышам, которым подкожно пересажена Саркома-180. Результаты показывают (см. табл.4), что эти вещества производят равное или более высокое противоопухолевое действие по сравнению с азотсодержащими полисахаридами, полученными в соответствии с обычнык методом экстрагирования горячей водой прн.нормальном давлении.

Предлагаемый способ позволяет получить полисахариды с высокой противоопухолевой активностью.

786855

Таблица

Цвет Примечание

Цветная реакция

Реакция с -нафтолом и серной кислотой (реакция

Иолиша Nol I sh) .

Пурпурный Подверждает сахарид

Реакция с индолом и серной кислотой (реакция Диша Dtsh) Коричневый То же

Реакция с антроном и серной кислотой

Зеленоватоголубой

То we

Реакция с Фенолом и серной кислотой

Коричневый То же

Реакция с триптофаном и серной кислотой

То же .

Пурпурнокоричневый

Способ Лоури-Фолина (4.оигу-Fotter) Подтверждает пеп тид ную связь

Реакция с нингидрином после гидролиэа с соляной кислотой

Фиолетовоголубой

Подтверждает -аминокислоту

Таблица 3,0 40i

160 .60 6,3 74,4 36,6 27, О

160 60 6 3 50 7 46 8 24с6

180 20 10r2 57,4 51,9 29,8

200 20 15,5 84,3. 50,3 42,4

0,1N — NaHGO

0,1N — ИаОН

50,0 38,1

180 60 10,2 72,6

180 180 18,0 .68,9

30,5 21,0

14% йН ОН

200 10 15 5 851 55 1 46 9

1% L — глутамин

Образец для сравнения

22 3 38 1 8 5 90 4 91

98 60

О, 1N — Na0H

П р и.м е ч а н и е. Образец для сравнения представляет собой образец, полученный с использованием того же самого баэидиомицета, что и для образцов с 1 по 8, в соответствии с обычным методом экстрагирования горячей водой при нормальном давлении.

О, 1И вЂ” йаНСО

2й — йанС03

О,fй — йаНСО

0,1й — йаНСО.

90 4,12

92 .3, 65

92 2,12

98 1,25

91 2,39

94 5,29

92 3,42

786855

Таблица4

Сравнительные данные по противоопухолевой активности (%) Полисахарид, полученный по предлагаемому способу

Полисахарид, полученный по известному способу

Доза, мг/кг

100

100

100

100

10

85-95

85-90

19

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор П. Горькова Техред Й.Ковалева Корректор О. Ковкнская

Заказ 8872/63 Тираж 673 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород . ул. Проектная, 4

1. Способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием, путем экстракции из грибов с последующей очисткой целевого продукта от балластных примесей, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения противоопухолевой активности полисахаридов, экстракции подвергают грибы Соriоlus Ьiformis, Coriо1us conchifåã, Corio1ив consors, Coriolus hirsutus, Coriolus pargamenus Согioius pubecens или Согlolus чегsiсоlor экстракцию ведут водой или разбавленным раствором щелочи при автоклавировании под давлением в течение 5-360 мин при 150-200"С.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что экстрагирование

35 ведут под давлением 5-20 кг/см

3. Способ по п.1; о т л и ч а ю— шийся тем, что экстракцию ведут разбавленным раствором щелочи в концентрации ниже 1 н.

20 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Японии 9 50-32304, кл. 30 А 3322, опублик. 20.10.75.