Синтетический амфолит-носитель дляразделения биополимеров методомизоэлектрофокусирования и изотахофореза
Союз Советскмк
Социалмстмческми
Республик
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свмд-ву (22) Заявлено 30.05.79 (21) 2770103/23-05 (51)М. Кл. с присоединением заявим Но (23) ПриоритетС 08 Q 73/02
Государственный комитет
CCCv по делам изобретений и открытий
Опубликовано 070281.Бюллетень Йо 5
Дата опубликования описания 090281 (5З) ЮК 678. 745. .2(088.8) (54) СИНТЕТИЧЕСКИИ АМФОЛИТ-НОСИТЕЛЬ
ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ВИОПОЛИМЕРОВ
METRON ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЯ
И ИЗОТАХОФОРЕЗА
Изобретение относится к получению амфолита-носителя для разделения и выделения различных биополимеров методами изоэлектрофокусирования и изотахофореза. 5
Известно применение сшитого водорастворимого полиэтиленполиамина (предпочтительно полиэтиленгексаамина. (ПЭГА), сшитого 0(,(з-ненасыщенными кислотами, в частности акриловой 10 кислотой, в водной среде при соотношении аминогруппа: кислота, равном ,2:1 (реагент "амфолин"). Время синтеза при этом от 2 до 60 ч, температу-. ра синтеза от 30 до 150 С (11 .
К недостаткам известного технического решения относят наличие нежелательного минимума электропроводности и буферной емкости у сфокусированных амфолитов-носителей в области нейтра- 20 льных рН (5-8); сложность предварительной ректификации ПЭГА (более
200©С при 0,5 мм рт.ст. в атмосфере очищенного аргона); высокая себестоимость получаемых амфолитов-носителей25
Цель изобретения — увеличение буферной емкости и электропроводности амфолитов-носителей в нейтральной области рН, а также -расширения сырьевой базы.
Цель достигается тем, что для разделения биополимеров методом изоэлектрофокусирования и изотахофореза ис- пользуют водорастворимые полимеры на основе низкокипящих полиэтиленполиаминов (ПЭПА), акриловой кислоты и
N,М -метиленбисакриламида. Низкокипящие ПЭПА, например дешевый и легкоочищаемый триэтилентетрамин (T3TA), имеют температуру кипения ниже 200oC/
/10 мм рт.ст., тетраэтиленпентамин (ТЭПА) ниже 270 С/10 мм рт.ст.
3а счет межмолекулярной сшивки укаэанных ПЭПА при помощи М,М -метиленбисакриламида увеличивается молекулярный вес амфолита-носителя. В связи с увеличением числа аминогрупп в молекуле уменьшается разница между константами диссоциации этих групп и увеличивается число изомеров с изоэлектрическими точками в нейтральной области рН, что ведет к увеличению буферной емкости и электропроводности
Способ получения полимеров осуществляют следующим образом.
К 25%-ному водному раствору перегнанного под вакуумом (водоструйный насос) ТЭТА или ТЭПА при нагревании и перемешивании добавляют М,N -метиленбисакриламида в мольном соотно802310
Формула изобретения
Составитель A. Переверзева
Редактор Л. Ушакова Техред М Лоя Корректор Н.Швыдкая
Заказ 10503/29 Тираж 541 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35 Раушская наб., д. 4 5
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 шенин 1:0,5. После центрифугирования при 5000 g в течение 30 мин к центрифугату добавляют при охлаждении и перемешивании акриловую кислоту до мольного соотношения аминогруппа: кислота, равного 2:1. Смесь нагрева|от при перемешйвании в течение 1620 ч при температуре 60-100оC. Все операции проводят в атмосфере инертного газа. Цля снижения поглощения в ультрафиолетовой области спектра полученных продуктов последние могут быть обработаны активированным углем.
Получаемый по предлагаемому способу амофлит-носитель может быть использован для разделения биополимеров с иэоэлектрическими точками, лежащими в интервале рН от 3,0 до 10,0 с высокой степенью разрешения.
Пример 1. В конической колбе, снабженной патрубками для ввода и вывода инертного газа н магнитнбй мешалкой, при нагревании растворяли 15,4 г К, Я -метиленбисакриламида в 116,8 г 25Ъ-ного водного раствора
ТЭТА. После центрифугироьания и отделения осадка добавляли акриловую кислоту (до значения рН 7,8 в 1%-ном водном растворе по отбираемым пробам). В круглодонной колбе, снабженной мешалкой, обратным холодильником и патрубком для ввода аргона, проводили синтез в течение 20 ч при температуре 70оC... Полученный амфолитноситель пропускали при 50оC через колонку емкостью 100 мл с влажным активированным углем и промывали колонку 100 мл дистиллированной воды.
Продукт концентрировали на пленочном испарителе до 40%-ной концентрации.
Выход амфолита-носителя 79%.
Пример 2. Процесс ведут аналогично гримеру 1, но порядок операций следующий. После добавления акриловой кислоты к раствору ТЭТА проводили синтез в течение 10 ч при 100 С, затем добавляли К, И -метиленбисакриламид, дополнительно нагревали с есь при перемешивании в течение
6 ч при 100ОС. После центрифугирования и очистки активированным углем продукт упаривали до 40Ъ-ной концентрации.
Выход амфолита-носителя 83%.
Амфолит-носитель, полученный по примеру 1, подвергали электрофокусированию на приборе LKB-2217 HULTIPH0R (Швеция). Определяли градиент рН и спектры разделения смесей белков.
Параллельно проводили опыт с "амфолинами". По разделяющей способности амфолит-носитель, полученный по предлагаемому способу, не уступает импортным амфолитам-носителям.
При титровании фракции амфолитовносителей, полученных при изоэлектрофокусировании в колонках с гелем
Молселект Г-50 (Венгрия), получены значения буферной емкости для известного амфолита и амфолита-носителя, полученного по предлагаемому способу.
15 Буферная емкость амфолита-носители полученного по примеру 1, в 1,2-2,5 раза выше в интервале рН 5-8, чем буферная емкость известного амфолита.
Преимущества предлагаемого способа получения амфолита-носителя слЕдующие: упрощается процесс и улучшается качество амфолита-носителя, снижается его стоимость по сравнению со стоимостью ныне импортируемых реактивов . Например, цена амфолита-носителя фирмы "Serve" (ФРГ) согласно рекламному проспекту на март 1977 r. колеблется в пределах 8500-21200 западногерманских марок в пересчете на
1 кг 100%-ного амфолита-носителя, цена же исходных компонентов для синтеза амфолитов-носителей.по предлагаемому способу намного ниже: ТЭПА
180 руб/кг, ТЭТА 80 руб/кг, акриловая кислота 30 руб/кг, N, К -метиленЗ5. бисакриламид 200 руб/кг. Следовательно, 1 кг 100%-ного амфолита-носителя (без учета затрат на труд) составит ориентировочно 70-100 руб/кг.
Применение сшитых водорастворимых4 полимеров на основе низкокипящих по-лиэтиленполиаминов, акриловой кислоты и N,N --метиленбисаариламида в качестве синтетического амфолита-носителя для разделения. биополимеров методом изоэлектрофокусирования и иэотахофореза.
Источники информации, принятые ьо внимание при экспертизе
1. Патент США Р 3485736, 260-75, опублик. 1969 (прототип).
