Способ разделения белков и нуклеи-новых кислот

 

ri» 810716

ОП ИСАН И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 07.12.78 (21) 269657li23-04 (51) N. Кл.з

С 07 б 7!00

С 07 Н 21/00 с присоединением заявки М—

Государственный комнтет (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллетень N- 9 (45) Дата опубликования описания 07.03.81 ссср по делам изобретений н открытнй (53) УДК 577.15.07:

: 547.963. .32.07(082) (72) Авторы изобретения

М. И. Болезнин, В. В. Мазанова и В. В. СмолянинФв

Всесоюзный научно-исследоватепьск11й институ

-.. 1 прикладной микробиологии I, :i (71) Заявитель и е п ЕQ (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ

И НУКЛЕИНОВЪ|Х КИСЛОТ

Изобретение относится к производству биохимических препаратов и может быть использовано на предприятиях, получающих ферменты и нуклеиновые кислоты из оиологического сырья.

Источником белков и нуклеиновых кислот часто служат клетки микроорганизмов.

Широко известны и хорошо разработаны способы выделения белков (например, ферментов) и нуклеиновых кислот из биологического сырья. Поскольку и белки и нуклеиновые кислоты одновременно присутствуют в клеточной массе (или приготовленном из клеток экстракте) вопрос выделения тех или других биополимеров неразрывно связан с их разделением.

Однако существующие в настоящее время способы выделения одного класса биополимеров из экстрактов клеток основаны на денатурации другого класса.

В частности, из описанных в лиг ратуре наиболее эффективен способ выделения белков, заключающийся в том, что экстракт клеток, полученный после отделения оболочек высокоскоростным центри<ругированисм, обрабатывают протаминсульфатом для удаления рибосом и нуклеиновь;х кислот, фракционируют белки в различных конпентрациях сульфата аммония, а дальнсйшу1о очистку проводят жидкостной хро2 матографией и гель-фильтрацией (1). При этом один из продуктов биосинтеза (нуклеиновые кислоты) становится отходом производства.

В TO >14C вреll5I «ля 11011 9O14115I iIX K1CIIIIO. вых кислот, в частности трзнсферпых рпбонуклеиновых кислот (тРНК), экстракт клеток для удалсния белков обрабатывают фенолом и дальнсйшую очистку т1 !1К npoið водят жидкостной хроматографией j2).

Прп применении указанных способов белки пли нуклеиновыс кислоты являются отходами производства, а для удаления нъ к:lеиновых кислот Ilciio. 11>ç÷oTñÿ дсфицит-!

5 ный препарат протаминсульфат.

Целью изобретения является болсе полное использование биологического сырья и предотвращение дснатурации белков и нуклеиновых кислот клеточного экстракта прп

gg их разделении.

Указанная цель достигается предлагаемым способом разделения белков и нуклеиновых кислот, содержащихся в клеточном экстракте после удаления клеточныx

25 оболочек и рибосом, заключающийся в ионообменной хроматографии экстракта на диэтиламиноэтилцеллюлозе в градиенте концентраций солей: NH4C1, или NaCl. или КС1 от 0,02 до 0,3 M в буферных зп растворах с рН 7,1 — 7,5, а затем — МаС!

810716

1О

20

Составитель О. Скородумова

Техред А. Камышникова Корректор О. Силуянова

Редактор Е. Хорина

Заказ 2151

Тираж 419 Изд. М 235

БИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, Раушская наб, д. 4/5

Подписное

Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома

3 от 0,3,1о 0,7 М в Ма-ацетатном буфере р Н 5,0 в 5,5.

Существенными отличиями способа яьляются осуществление ионообменной хроматографии экстракта клеток на диэтиламиноэтилцсллюлозс и указапныс условия сс пl)ol)cäcíия.

При осуществлении способа обычно используют клеточный экстракт, полученньгй после удаления клеточных оболочск высокоскоростным цснтрифугированием и рибосом — ультрацснтрифугироваписм (105000 g).! Iримср 1. 500 r бактериальной массы

Escherichia coli штамм МРЕ-600, дсзинтсгрируют растиранием с окисью алюминия, дезинтегрированную биомассу суспспдиру1от в 800 мл буфсра, рН 7,5, содержащего

0,02 М x,loðHñòoãо аммония, осаждают клеточные обломки и окись алюминия высокоскоростным центрифугированисм прп

27000 g и осаждают затем рибосомы уль рацснтрифугированием прн 105000 о. Супсрпатант после отделения рибосом наносят H колонку с ДЕЛЕ-целлюлозой, уравновешенной буфером, рН 7,5, содержащим

0,02 М хлористого аммония. З.поцию белков провод11Т В градис111с концсптрацHи хлористого аммония от 0,05 до 0,3 М. Затсм ДЕЛЕ-цслли)лозу уравпоьсшивают

0,05 М натрий-ацетатным буфером, р1-1 5,0, софср)нашим 0,3 М хлористого натрия и rP1 II(элюиру1от 1ювышенисм конпсптрации хлористого натрия до 0,7 М.

11з белковой фракции выделяют в чистом ви,1с фактор элонгации Г (El Сг) в Количсствс 220 мг, выход тРНК составляет 1 г.

Примср 2. 100 г клеточной массы E. coli, М RE-600, инфш1ированной бактериофагом

Т4 ап 1),г "в 82, суспендируют в 300 мл

0,01 М трис НС! буфера, рН 7,6, содержащсго 0,001 М xrloðHcòoão магния, и 0,01 М мсркаптоэтанола (буфер Л). Клетки разруIlla IoT ультразвуком. Клс! Очгlыс ОблОмки осаждают цснтрифугированием в роторе (ВСС1<п)ап) при 35 000 oo/ìèu в течение

3 ч. Супернатант наносят на колонку

5ХЗО см с ДЕЛЕ-псллюлозой со скорость)о

250 мл/и. После промывки колонки 1,5 л буфера Л до исчезновения поглощения на длине волны 280 пм элюируют белки в линейном градиенте из 0,02 и 0,3 М хлористого натрия в буфсре Л (общий обьсм гра4 диента 6 л). Фракции ДНК- и РНК-лигаз определяют по комплексообразованию с (зН) АТФ. Фракцию ДНК-лигазы далее очищают хроматографией на фосфоцелл1олозс H гидроксилапатите. Выход составляет

21,8% от активности в грубом экстракте.

Фракцию РНК-лигазы далсс очищают хроматографией на гидроксилапатитс и гельфильтрацией на ультрагеле ЛСЛ-44. Выход составляет 36,5% от содержания в грубом экстракте.

После элюции ДНК- и РНК-лигаз колонку с ДЕЛЕ-цсллюлозой уравновешивают 0,05 М натрий-ацетатным буфером, рН

5,0, содержащим 0,3 М хлористого натрия. тРНК элюируют этим жс буфером, содержащим 0,7 М хлористого натрия. Выход тРНК составляет 50 мл.

Формула изобретения

l. Способ разделения белков и нуклеиновых кислот, содер>кап1ихся в клеточном экстракте после удаления клеточных оболочек и рибосом, отл и ч а ю щи и ся тем, что, с целью предотвращения дснатураци-1 белков или нуклеиновых кислот и более полного использования биологического сырья, разделение осуществляют ионообменпой хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозс в градиенте концентрацией солей: хлористого аммония, или хлористого натрия, или хлористого калия от 0,02 до

0.3 М в буферных растворах с pI-1 7,1 — -7,5, а затем — хлористого натрия от 0,3 чо

0,7 М в натрий-ацетатном буфере рН

5,0 — 5,5.

2. Способ по п. 1, отличаюп,ийся тем, что используют клеточный экстракт после удаления клеточных оболочек высокоскоростным центрифугированием и рпбосом — ультрацентрифугированием (105 000 g) .

Источники инфоимации, принятые во внимание при экспертизе

1. G. Каз1го, N. Опо1)с Golcosawa, М. Kawakita. «Studies on Polypeptide Elongation

Factor fiom Е. coli. I, Crystalline Factor G.»

G Biochem., 72, 1972, 853 (прототип).

2. 1. Н, Brubaci

amino acid trausfer ribonucleic acid from

E. coli by direct phenol extraction of intact

cells». Biochem. Biophys. Acta, 76, (1963), 48,