Способ выделения протеина

 

И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (aaj 784 784

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту(51)М. Кл.з (22) Заявлено 26,04,78 (21) 2614452/23-04 (32) 26.04.77

12.04.78

С 07 G 7/00

С 07 G 7/06

С 07 С 103/52 (23) Приоритет

7712518 .

7810769

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (33) Франция!

Опубликовано 30.11.80 Бюллетень ¹ 44 (53) УДК 547. 964.

4 07 (088 8) Дата опубликования описания 301180

Иностранцы

Шарль Дюлу, Андре Пейрузе, Рене Панари, Клод Аннун и Жан Весан (Франция)

Иностранные фирмы

"Сосьете Насьональ Елф Акитэн" (Продюксьон) (Франция)

"Энститю Пастер, Фондасьен Реконню д Ютилит Пюблик" (Франция) (72) Авторы изобретения (71) Заявители (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНА

Изобретение относится к способу выделения протеинов с различными молекулярными массами, с использованием хроматографии, который может найти применение в микробиологии для выделения и очистки вирусов.

Разделительная хроматография широко используется для очистки и разделения организованных фракций бактериальных или вирусных тел, макромолекул (1, 2 j. Высокой чистоты протеины-вирусы получены при использовании хроматографии на эластичных гелях, например шариках arapa (1).

Однако этот носитель имеет существенные недостатки: низкую механическую прочность, не выдерживает стерилизации нагреванием, что ограничивает его применение для разделения продуктов, которые должны быть сохранены стерильными.

Наиболее близким к описываемому является способ разделения протеина хроматографией на силикагеле 2); силикагель промывают водой, 1Ъ-ным водным раствором карбовакса 20 М при 90 С, при последующей промывке температуру снижают до 9оС. Затем колонку вновь промывают водой и буфером (рН 5,5-7,6), разделение проводят при низкой температуре (9 С), о дезактивация силикагеля карбоваксом

20 М предотвращает адсорбцию протеинов, разделение их осуществляют за счет градиента концентрации соли в элюирующем буфере и изменения рН и при приложении повышенного давления (несколько десятков бар).

Недостаток способа состоит в том, что протеины могут быть разделены только под действием сильных давлений. Кроме того, способ применим только к аналитически чистым протеинам невысокой молекулярной массы (25 000 — 800 000): лизоцим, альбумин, каталаза, тироглобулин, цитохром С.

СпосОб неприменим к протеинам с вы2() сокими молекулярными массами (выше миллиона), с чем встречаются при выделении и очистке вирусов гриппа, средние молекулярные массы которых выше нескольких миллионов.

25 Цель предлагаемого изобретения— способ выделения протеинов с высокими молекулярными массами и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается

30 описываемым способом выделения про

784784 теина из водной среды путем разделительной хроматографии на твердом носителе, предварительно лассивированном водным раствором полимера и элюированием протеина буферным раствором с рн 5,5-7,6, заключающийся в том что в качестве твердого носителя используют силикагель или силикат щелочного металла с частицами размером от 40 до 200 мкм, порами диаметром от 5 до 200 нм, носитель после первичной пассивации водным раствором полимера с молекулярной массой от 5000 до 30000, пассивируют повторно 0,2-20;- ным водным раствором протеина с молекулярной массой меньше молекулярной массы выделяемого протеина.

Предпочтительными вариантами способа являются использование в качестве полимера для первичной пассинации полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона или полипропиленгликоля.

В качестве протеина для повторного пассивирования протеины с молекулярным весом меньше 100000 — альбумин„ желатин, пеп:он или продукты разло-жения полипсптидов. Нспользование буферного раствора с добавкой анти— септика в количестве от 0,1 до 10 г, представляющего собой дихлорметан, дибромметан, дийодметан, 1,2-дихлорэтан, дибром-1,2-этан или трихлорэтил" н. Нспользование в качестве выделяемого пептида вируса.

Пример 1. Подготовка колонны. Колонну с внутренним диаметром

10 см и высотой 120 см заполняют порошком силикагеля "Сферозил Хов

// Ir

030" (PGH""Ïóëåíê) в виде частиц размером 100-200 мкм, со средним диаметром пор 60 нм и удельной поверхностью 50 м /г, объем пор наполните—

2 ля 1 мл/г. После стерилизации паром, помещенный в колонну гель предва— рительно пассивируют, т.е. обрабатывают водным 1 .-ным раствором полиэтиленгликоля молекулярной массы

20 000 в течение 24 ч для блокировки его адсорбционноспособных участков. Затем в колонну загружают

500 мл не содержащей гриппозный вирус алантоисной жидкости, с помощью которой проводится повторная пас=ивация.

Циркуляцию раствора через колонну осуществляют при незначительном повышении давления на входе в колонну (примерно 1 бар.).

Иэ 450 мл вирусного раствора в результате его хроматографическои очистки получают 1050 мл элюата, содержащего вирус ьысокой степени чистоты.

На чертеже представлена хроматографическая кривая выделения вируса гриппа штамма А/х53 иэ его алантоисной питательной среды, по оси ординат отложены оптические плотности

1О $

2О .«5

5Î

65 элюата, по оси абсцисс — объемы элюата. Чистому вирусу соответствует пик V, примесям соответствует пик 1, прерывистость пика 1 вызвана изменением расхода элюата с 9 до 27 л/ч.

При работе с аналитической хроматографической колонкой (диаметр 0,8 см, высота 120 cM), заполненной такой же двуокисью кремния, как указанс вь|ше, получают раствор чистого вируса, не содержащий примесей (1050 мл).

Баланс составляют путем определения активности вируса в растворе по методу гемагглютинации (ГА). Установлено, что в 450 мл исходного алантоисного раствора активность составляет 1200 единиц ГА/0,25 мл. Активность раствора вируса после хроматографической очистки — 480 единиц

ГА/0,25 мл. Объем элюата — 1050 мл.

Таким образом, активность в исходно л растворе 2160000 единиц ГА, активность в очищенном растворе вируса 2016000 единиц ГА. Следовательно, выход: (2016000:2160000)x100 = 93,8%.

Этот выход намного выше выхода, получаемого при использовании известного метода очистки.

За этой двойной пассивацией следует промывка водным стерильным буферным раствором первичного фосфата калия и вторичного фосфата натрия с рН 7,5, содержащим NаС! в концент— рации 0,15 М.

Пример 2. Выделение вируса гриппа штамма А/х53 из его алантоисной питательной среды. Раствор вируса из классической культуры в алантоисной полости куриного эмбрионального яйца, после инкубации в течение 10- 12 дней содержит 1 200 единиц ГА (метод гемагглютинации) на

0,25 мл.

450 мл этого раствора вводят в колонну, скорость пропускания раствора 150 мл/мин. В "".å÷åíèå этого времени через колонну постоянно пропускают буферный раствор со скоростью

9 л/ч до появления одного вируса на выходе из колонны (30 мин). Скорость подачи буфера утраивают (до 27 л/ч), что позволяет провести весь процесс ч

Колонна, снабженная автоматическим устройством, функционирует без перерыва в течение всего необходимого для проведения процесса времени., Определение составляющих элюата на выходе из колонны осуществляют по оптической плотности в ультра-фиолетовой области при длине волны 252 нм.

Пример 3, Выделение гриппозного вируса двойным способом адсорбции — элюирования на зритроцитах с последующей очисткои путем хроматографии на силикагеле.

5.0 л вирусных алантоисных жидкостей, происходящих из эмбриональных куриных яиц, 10- 12 дневных, предва784784

Полученный таким образом раствор центрифугируют для удаления нерастворимой части и верхнюю прозрачную жидкость (около 500 мл) собирают.

Выход этой операции концентрирования-очистки найден близким к 65Ъ, 500 мл этого концентрированного раствора хроматографируют в колонне с внутренним диаметром 10 см и высотой 120 см снабженной такой же двуокисью кремния, что и в примере 1, и используют такой же буферный раствор. 500 мл вводят как описано в примере 2. Вирус собирают элюированием в 1500 мл раствора, титр которого

65 рительно осветляют центрифугированием, для удаления нерастворимых веществ. Надосадочная жидкость имеет

1200 единиц ГА в 0,25 мл.

К полученной жидкости добавляют

4 об.Ъ осадка куриных эритроцитов.

Через 8-16 ч при температуре +4 С о или +37 С, эритроциты отделяют центрифугированием со скоростью 3 000 об/ мин и вирус элюируют фосфатным буфером в объеме 5 л. Элюат имеет гемагглютинатный титр 12000 единиц ГА в

0,25 мл. 450 мл этой вирусной суспензии автоматически вводят в колонну, в течение 3 мин (с расходом

150 мл/мин). В течение этого времени непрерывно пропускают через колонну описанный в примере буферный раствор(расход этого раствора 9 л/ч) до появления только одного вируса на выходе из колонны. Расход утраивают (27 л/ч), когда в элюате не обнаруживают более вируса, элюат при этом содержит загрязненные протеины.

Каждая операция длится 1 ч. Благодаря своему автоматическому устройству, колонна функционирует непрерыв- 25 но, при этом расходуется 5 л элюата.

Фракции, соответствующие очищенным вирусам, собирают, получают 15 л.

Титр этого раствора в гемагглютинатных единицах составляет 32 00 единиц ГА на 0,25 мл, что означает выход порядка 100%.

Пример 4. Исходя из 10 л раствора алантоисной жидкости, заряженной гриппозным вирусом, подобного описанному в примере 2, осуществляют в первой стадии концентрирование-очистку на полимерном комплексе кальция. Для этого к раствору добавляют водный 2Ъ-ный (вес.Ъ) раствор полиэтиленгликоля молекулярной мас- 40 сы 20 000 и 12 г СаСС2 в виде порошка.

Смесь гомогенизируют в течение

30 мин, осадок отделяют декантацией с последующим центрифугированием, осадок обрабатывают примерно 500 мл водного 0,2 M раствора динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, рН которого доведен до

7,5 с помощью б н. раствора едкого натра. 50

10 800 единиц ГА/0,25 мл, что соответствует выходу очистки, близкому к 98%. Полученный раствор вируса одновременно очень чистый и концентрированный.

Пример 5. Алантои ную зараженную жидкость, как описано выме, концентрируют диафильтрацией на мембранах или полых волокнах.

50 л таким образом доводят до объема 5 л или меньше. После осветления этот концентрат непосредственно вводят в колонну, согласно описанной в предыдущих примерах модели и по такому же способу.

Вирусный пик содержит совокупность гемагглютинатных единиц, которые были предложены. Этот раствор, очень чистый в отношении протеинов, может быть загрязнен фосфолипидами желточного мешка, организованными в мицелы, это загрязнение отделяют ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы.

При удалении всех примесей с помощью разделительной хроматографии выход на всех операциях увеличивается.

Пример б. 500 л зараженной алантоисной жидкости, как описано выше, очищают путем ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы. Объем фракций, соответствующий пику вируса на графике, составляет объем

Выход этой операции 30-80%. Эту фракцию вводят автоматически в колонну с силикагелем, как это описано в примере 2, и осуществляют разделительную хроматографию по способу этого примера. Собирают 3 л элюата.

Выход операции хроматографии близок к 100Ъ.

Пример 7. Операции, реализованные в этом примере, идентичны таковым описанным в примерах 2, 3, 4, 5 и 6. .Однако вирусная суспензия, подвергнутая разделительной хроматографии, предварительно инактивирована формалином, 9 -пропиолактоном или ультрафиолетовым излучением, и/или обработана органическим растворителем.

Пример 8. Хроматографическую колонну, подготовленную согласно примеру 1, используют для очистки водного, с примесью, раствора каталазы, извлеченной из бы:ьей печени.

Этот раствор имеет активность 220 международных единиц. Элюат буферируют при рН 7. Получают раствор с активностью 1800 между народных единиц, выход составляет 86%.

Пример 9. Повторяют операции, опис"ííûå в примере 2 при использовании описанной в примере 1 колонны, Но наполнитель колонны представляет собой стеклянные шарики размерами 80-280 мк, среднии диаметр пор которых составляет 50 нм.

784г84 (10

Выход очищенного вируса составляет 87%, Пример 10. Очистку вируса штамма В/НК осуществляют согласно примерам 1 и 2, за исключением второй пассинации наполнителя колонны, используют 500 мл водного 6Ъ-ного раствора лактальбумина молекулярной массы около 18 000. Выход 92Ъ.

Пример 11. Указанный в примере 10 лактальбумин заменяют (8Ъ-ным растнором мясного пептон.а, т.е. продуктов протеолиза полипептидов мяса. Выход составляет 93%, Пример 12. После выделения вируса согласно примеру 2 полученный продукт (A) исследуют с точки зрения его микробной флоры: количество микробон на мл указано ниже„

Подобное выделение осуществляют с той разницей, что к буферному раствору добавляют 5 r хлороформа на 2О литр для стерилизации среды: полученный раствор В содержит очень глало микро" îâ. .В операции С добавляют тот же антисептик в количестве

5 г/л как к буферному раствору, так д5 и к обрабатываемой жидкости. Результат подобен B. Вирусную среду подвергают зональному ультрацентр,лфугированию, после обычного добавления 0,01% метиолята и 0,02% формальдегида.

Получены следующие результаты, микробон/мл:

А. Хроматография, без антисептиков 10

В. Хроматография, хло- 35 роформ в буфере

С. Хроматография, хлороформ н буфере и н обрабатываемой жидкости <10 40

Д. Зональное ультрацентрифугиронание метиолят + формальдегид 3 000

Кроме того, полученные н операциях А, В и С вирусы живые, в то 45 время как полученный в операции Д вирус неактивен. Более того, полученные в результате операций B и С, с хлороформом, процукты сохраняют тот же самый инфекционный титр и обладают той же самой гемагглютинатной способностью, как и продукт, полу военный н операции А, выделение которого осуществлялось без всякого антисептика.

Пример 13. Вирусный раствор, подобный тому, что использован в опытах А-Д в примере 1, но соответствующий другим штаммам вируса, подвергают разделению по способу,, описанному в примере 2. 60

Таким образом, были исследов аны жидкости, полученные н 3 штаммон вирусов гриппа: А/СССР, А/Техас,, В/HK.

В каждом случае, осуществляют хроматографию, злюируя буферным раст- $5 вором, содержащим 5 r хлороформа в 1 л или без хлороформа. Кроме того, проводят сравнительные выделения путем зонального центрифугиронания.

Ниже даны выход, Ъ по отношению к исходной жидкости, и вирусный титр (в международных единицах на мг про— теина).

Выход, %

А/СССР А/Техас Н/НК

Хроматография с хлороформом 88

Хроматография без хлороформа 81

Зональное ультрацентрифугирование (метиолят+формальдегид) 72 63

77,5 88

71,5 81

Международная ед/мг протеина

Хроматография с хлороформом 19800 23400 26200

Хроматография без хлороформа 15900 12100 19200

Зональное ультрацентрифугирование (метиолят+формальдегид) 12900 13600 15300

Результаты показывают, что добавление хлороформа улучшает как выход, так и концентрацию вируса в полученном продукте. Из результатов, полученных при осуществлении процесса описанного в примере 13 найдено, что выделенный в присутствии хлороформа вирус живой и имеет тот же самый инфекционный титр и обладает той же самой гемагглютинатной способностью, как и вирус, полученный в результате хроматографии без хлороформа. Напротив, выделенный центрифугированием с классической стерилизацией вирус является неактивным.

Пример 14. В операциях, подобных B и С примера 12, используют бромоформ н концентрации около I г/л, что соответствует максимуму растворимости СНВгз в воде. Находят около сотни микробов, на мл, в конечной жидкости.

Пример 15. Замена хлороформа н примере 12 на 1,1,2-трихлорзтан, по 4 г/л (растворимость 4,4 г/л при 20 С), приводит к значительному о уменьшению микробной флоры, менее

30 микробов/мл.

Пример 16. Операции примера

2 реализуются в колонне, описанной н примере 1, но беэ второй пассива784784

10 ции, т.е. без обработки наполнителя алантоисной . жидкостью. Выход вируса равен 70%.

Пример 17. Работая без второй пассивации, как в примере 16, причем наполнитель представляет со бой такие же стеклянные шарики, как в примере 9, получают выход 64% (по сравнению с 87%, пример 9).

Условия расхода элюирующего средства, количество обрабатываемой инжектируемой в колонну жидкости, I частота этой инжекции, описанные в примерах, не являются ограничительными, их можно изменять в широких пределах.

Пример 18. Растворы алантоисной жидкости, зараженной вирусом, приготовляют известным образом, с помощью различных штаммов вируса.

В эти растворы вводят 6 г/л хлороформа.

Ниже показано, что введение хлороформа не изменяет инфекционный- титр и гемагглютинатную способность этих растворов.

A/Âèêòî- A/Õ47 НК 73 рия 75

200

Титр: ГА до хлороформа спустя 24 ч спустя 2 дня спустя 3 дня спустя

5 дней

230

160. 290

160 280

160

Показатель

Пример

Диаметр частиц, мкм 100-200 50-100 100-200 40-80 50-150

Средний диаметр пор, нм

140

10 180

Удельная поверхность м /г

2 рН элюента

230

420 30

6,7 5,6

7,5

7,0

6,5

1-й агент пассивации

Полиэтиленгликоль Поливинилпирро- Полипролиден пиленгликоль молекулярная масса 20000 6000 29000

2-и агент пассива- Яичный альбумин (незаряжен- Пепции, ная алантоисная жидкость) тон, Лактальбумин

44000 18000

93,0 92,6 92,9 90,7 молекулярная масса

Выход, Ъ

93,3 тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве твердого носителя

d0 используют силикагель или силикат щелочного металла с частицами размером от 40 до 200 мкм, порами диаметром от 5 до 200 нм, носитель после первичной пассивации водным раст65 вором полимера с молекулярной массой

Формула изобретения

1. Способ выделения протеина из водной среды путем разделительной хроматографии на твердом носителе, предварительно пассивированном водным раствором полимера и элюированием протеина буферным раствором с рН 5,. -7,6, отличающийся

Инфекционный титр: без хлороформа 10 10 25 10 5-5 с хлорофор5 мом 10 10 10 "

Пример 19. Испытания, аналогичные тем, которые проведены в примере 13 с различными антисептиками в буферном растворе, дают следующие результаты.

Антисептик Концентра- Микробы, ция, г/л обнаруженные на мп (средние округлен15 ные значения) Никакой 10>

Дихлорметан 6 200

Дибромметан 6 100

2р Дийодометан 6 40 . Дихлор-1, 2—

-этан 6 160

Дибром-1,2этан 4

25 Трихлсрэти лен 1 300

Пример ы 20-23. По методу проведения примеров 1 и 2, проведены хроматографические анализы, и при этом проводилось изменение некоторых факторов, которые указаны в таблице, где результаты примера 2 приведены в качестве сравнения.

784784

Приоритет по пунктам:

26.04.77 — по пп. 1, 2, 3, 5

10 12.04.78 — по п. 4.

Составитель B. Волкова

Редактор Л. Герасимова Техред А, Бабинец Корректор О. Билак

Заказ 8594/б7 Тираж 495

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул . Проектная, 4 от 5 000 до 30 000, пассивируют повторно 0,2-20-о-ным водным раствором „ протеина с молекулярной массой меньше молекулярной массы выделяемого:; протеина, 2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве полимера для первичной пассивации используют полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон или полипропиленгликоль.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что протеин используемый при повторном пассивировании, имеет молекулярный вес меньше 100 000 и представляет собой альбумин, желатину, пептон или продукты разложения полипептидов.

4. Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в буферный раствор добавляют антисептик в количестве от 0,1 до 10 г, представляющий,с собой дихлорметан, дибромметан, дийодметан, 1,2-дихлорэтан, дибром-1,2-этан или трихлорэтилен.

5. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве выделяемого протеина, используют вирус.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. S. Bengtsson, L. Philipson, "Chromatography of animal viruses

15 or, pearl-condensed. agar", Вiochim.

Biophy s. Асса 1964, 79, 399.

2. Jshaiuhu Shechter, "Separation

of Proteins Ь High-Speed Pressure

liguid Chromatography, Analy t. BiogQ chemistry, 1974, 58, 30,