Патент ссср 826241

 

Союз Советских

Социалистических

Республик (11)826241

Ф

44Ф

/ =- (61) Дополнительное к авт. саид-ву

1 (53)Я. f(n.э (22) Заявлено 260379 (21) 2742062/28-13 с присоединением заявки ¹

G 01 N 33/52

Государственный комитет

СССР по дедам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 300481. Бюллетень М 16 (53) УДК 612.129 (088. 8) Дата опубликования описания 300481

A.Á. Самаль, С.Н, Черенкевич, .и А.N. Kjo od I

° . Q с;

° - - - гЮ ! . 1 ;, ; 1: .;

Белорусский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В.И. Ленина (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ CEPOTOHHHA

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

20

30

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано как физико-химический метод исследования серотонина и определения его концентраций в биологических средах, крови, плазме, суспензиях тромбоцитов и т.д.

Известен способ определения серотонина в биологических жидксстях путем измерения интенсивности их флюоресценции до и после обработки биологической жидкости,перекисью водорода (1 1.

Однако. определить серотонин известным способом сложно, требуется

Много времени и происходят большие потери серотонина при экстрагирова- нии (до 50%).

Цель изобретения — повышение точности способа.

Эта цель достигается тем, что способ определения серотонина в биологических жидкостях осуществляют путем измерения интенсивности их флюоресценции до и после обработки биологической жидкости перекисью водорода, при этом-биологическую жидкость обрабатывают перекисью водород . при концентрации последней

0,0003-0,00ЗЪ в присутствии пероксидазы.

Для определения серотонина, определяют уровень интенсивности ультрафиолетовой флюоресценции раствора. содержащего серотонин, затем добавляют пероксидазу и Н Оо .(в концентрации 0,003-0,0003%). Завершение реакции сопровождается полным исчезновением ультрафиолетовой флюоресценции серотонина.

Таким образом, по исчезновению ультрафиолетовой флюоресценции серотонина, исходная интенсивность которой пропорциональна исходной концентрации серотонина, определяют его концентрацию. Исследование люминесценции проводят на обычнйх флюориметрических установках, работающих в режиме измерения среднего тока или счета фотонов.

В результате исследований спектров поглощения люминесценции серотонина и перекиси водорода установлено, что поглощение используемых концентраций Í О > (0,003-0,0003а) незначительно,и экранирующего эффекта И О на флюоресценцию серотонина нет.

826241

0,1 мл 0,05 — пероксидазы и 0,1 мл

О,ООЗВ-ного Н О . Фиксируют изменение флюоресценции и полученный результат сопоставляют с калибровочной кривой.Для построения калибровочной кривой используют серотонин в той же среде, что и тромбоциты. Линейная зависимость интенсивности флюоресценции серотонина на длине волны ЗЗО нм от концентрации серотонина сохраняется до концентрации 10 8М.

В таблице представлены данные определения серотонина по предлагаемому способу в отмытых.тромбоцитах.

Из данных приведенных в таблице, видно, что при стимулировании тром1Я боцитов тромбином или изменении рН, происходит выделение серотонина, концентрация которого легко определяется предлагаемым способом. При добавлении серотонина к тромбоцитам, на О ходящимся в среде с рН 7, б, т.е к стимулированным тромбоцитам, поглощения серотонина нэ происходит и общая концентрация определенного серотонина состоит из серотонина, вышедшего из тромбоцитов при их сти25 мулировании изменением рН. среды, и серотонина, добавленного в раствор (10 М) .

Предлагаемый способ определения серотонина обладает высокой чувст39 вительностью, не требует применения дополнительных методов обработки биологических жидкостей, является добавляют специфическим и экспресс-методом.

В присутствии 0,01 мг/мл перокси дезы и 0,003-0,0003,перекиси водорода происходит полное окисление серотонина в широком диапазоне концентраций 10 4- 10 М. Время определения серотонина в жидкости в этом случае 5-10мин.Варьированием ввг концентраций пероксидазы (0,2-0,001 †) и НйО (0,003-0,0003Ъ ) время определения серотонина можно сократить до 25мин.Во всех случаях соблюдается линейная зависимость Ы=(1Н -I) после окончания реакции от концентрации серотонина.

С целью проверки специфичности этой реакции исследован целый ряд триптаминов, ароматических аминокислот и белков плазмы.

Добавление пероксидазы и Н20 не приводит к изменениям интенсивности флюоресценции этих веществ, поэтому наличие их в биосистемах не оказывает влияния на. определение концентрации серотонина.

Пример ° Определение концентрации свободного серотонина в реакции высвобождения из тромбоцитов под действием агрегирующих агентов„

Для этого из тромбоцитов (число клеток 100 мл) при инкубировании последних в среде с агрегирующими агентами (рН 7,6 тромбин) к надосадочной жидкости (1,8 мл}, получаемой после центрифугирования взвеси сти-, мулированных тромбоцитов, Объект исследования

Стимулирую- Относит. щий фактор ед. Ы

Концентрация серотонина

{на 108 клеток) рН,Тромбоциты о

6,5

1100 2,2 10 М

1500 3 10 М

Тромбоциты

Тромбоциты

Тромбоциты

7,6

6,5 . Тромбин 10 М

6,5 Серотонин

10 М

1400 2, 8- 10 М

Стандарт серотонина

6,5 и

7,6, l0 М

10 М

500

П р .и м е ч а н и е . Изменение .интенсивности флюоресценции тромбоцитов при добавлении к ним пероксидазы и Н2 0 (А 296 нм, Аур, 330 нм) .

Формула изобретения

55 биологическую жидкость обрабатывают перекисью водорода при концентрации

Способ определения серотонина в 0,0003-0,003% в присутствий .пероксибиологических жидкостях путем измерения интенсивности их флюорес- Источники информации ц нции до и после обработки биологи- принятые во внимание при экспертизе е

1 ческой жидкости перекисью водородаг бО 1. Патохимия и клиническая биохиотличающийся тем, что. мкя. Сборник научных трудов. Иркутск, целью повышения точности споаоби, " 1973, 121, с. 84-85.

ВНИИПИ Заказ 2368/33 Тираж 907 Подписное

Филиал ППП "Патент", r.Óæãoðoä, ул.Проектная,4