Способ определения поврежденияклеток ультрафиолетовым излучением
О П И С А Н И Е ((Н834435
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Союз Советсник
Социалмстичесних
Респубттин
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 31.07.78 (21) 2650996/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. Кл.з
G О! N 1/28
Гооударстееиный комитет
Опубликовано 30.05.81. Бюллетень №20
Дата опубликования описания 05.06.81 (53) УДК 615.475 (088.8) по делам изобретеиий и открытий (72) Авторы изобретения
В. А. Крыленков, С. В. Левин и К. А. Самойлова
1 . Ä (71) Заявитель
Институт цитологии АН СССР ю (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ
КЛЕТОК УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ
Изобретение относится к медицине, а именно цитологии.
Известен способ определения повреждения клеток ультрафиолетовым излучением путем окрашивания их с последующей спектрофотометрией (1) ..
Однако данный способ не позволяет выявить повреждения клеток на ранних стадиях.
Цель изобретения — выявление ранних стадий повреждения клеток.
Поставленная цель достигается путем окрашивания клеток с последующей спектрофотометрией, при этом клетки окрашивают
0,01 — 0,015%-ным раствором альцианового синего и по содержанию красителя, сорбированного на клеточной мембране, определяют стадию повреждения клеток.
Пример 1. Клетки. асцитной гепатомы
Зайделя получают от беспородных крыс весом 120 — 150 г. Животных забивают, выделяют асцит, наслаивают его на физиологический раствор 0,9% NaCl при рН 7,4. Со-: держащиеся в растворе клетки 2 — 3 раза отмывают от асцитической жидкости, центрифугируя при 80 — 100g. После отмывки клетки ресуспензируют в физиологическом растворе, доводя концентрацию до 10 кл/мл.
К 1 мл суспензии клеток, содержащей
10 кл/мл, прибавляют 2 мл 0,015%-ного альцианового синего (АС) . Конечная концентрация красителя составляет 0,01%.
Смесь инкубируют 30 мин, затем клетки осаждают центрифугированием при 27000 g в течение 15 мин при 4 С. Надосадочную жидкость, представляющую собой раствор
10 красителя, спектрофотометрируют в диапазоне 480 †8 мм, концентрацию раствора
АС после окрашивания им клеток определяют по величине максимального поглощения красителя при Я = 617 нм. После этого осадок окрашенных клеток промывают в 1 мл физиологического раствора (для удаления слабосвязанного с клетками альцианового синего) и еще. раз центрифугируют при
27000 тз 15 мин при 4 С. Надосадочную жидкость спектрофотометрируют в диапазоне 480 — 830 нм и по величине максимального поглощения красителя приА =617 нм определяют концентрацию остаточного и слабосвязанного красителя. Затем расчитывают коэффициент распределения слабосвязан8 34435 ного красителя между клеткой и средой по формуле
С Кис
cg и, I где Q — коэффициент распределения слабосвязанного красителя;
С вЂ” концентрация раствора АС после окрашивания им клеток, ед. оптич. плотности;
C5 — концентрация слабосвязанного
4 освобождающегося при промывке клеток) красителя, ед. оптич. плотности;
V< > — объем клеточной суспензии, мл;
/1 — количество в ней клеток;
Vsqk4 — объем внешнего примембранного слоя одной клетки, Еп, который вычисляли по формуле: валс = - 1вж 11, где S» .— площадь внешних лримембранных слоев (ВПМС), равная площади поверхности клетки;
tl — толщина ВПМС, равная 1 мкм.
Отмытый осадок клеток вручную гомогенизируют в 3 мл 2 /о-ного водного раствора додецилсульфата натрия, в котором клетки частично растворяются, а частично диспергируются.
Полученный препарат спектрофотометрируют в диапазоне 480 — 830 нм, концентрацию экстрагированного красителя определяют в максимуме поглощения красителя при-617 нм с поправкой на светорассеяние суспензии. Коэффициент распределения красителя между поверхностью клеток и средой рассчитывают по формуле:
Vc yen. сг ifm„e.п. 1 где Q — коэффициент распределения;
С© — концентрация экстрагированного красителя, ед. оптич. плотности;
С5 — концентрация красителя в физиологическом растворе после окрашивания им клеток, ед. оптич. плотности.
Пример 2. Клетки асцитной гепатомы
Зайделя получают от беспородных крыс весом 120 — 150 г. Животных забивают, выделяют асцит, наслаивают его на физиологический раствор 0,9 /o NaCt при рН 7,4. Содержащиеся в растворе клетки 2 — 3 раза отмывают от асцитической жидкости, центрифугируя при 80 — 100g. После отмывки клетки ресуспензируют в физиологическом растворе, доводя концентрацияю до 10 кл/мл
Дальнейшие операции производят аналогично изложенному в примере 1.
Пример 3. Клетки асцитной гепатомы
Зайделя получают от беспородных крыс весом 120 — 150 г. Животных забивают, выделяют асцит, наслаивают его на физиологи35 ческий раствор 0,9 /р NaC1 при рН 7,4 и клетки 2 — 3 раза отмывают от асцитической жидкости, центрифугируя при 80 — 100g. После отмывки клетки ресуспензируют в физиологическом растворе, доводя концентрацию
5 до 106 кл/мл.
К 1 мл суспензии клеток, содержащей
10 кл/мл, прибавляют 2 мл 0,015 /o-ного альцианового синего. Конечная концентрация красителя составляет 0,01 /о. Смесь ин 0 кубируют 30 мин, затем клетки осаждают центрифугированием при 27000 g в течение
15 мин при 4 С. Надосадочную жидкость, представляющую собой раствор красителя, спектрофотометрируют в диапазоне 480—
830 нм, концентрацию раствора альцианового синего после окрашивания им клеток определяют по величине максимального поглощения красителя при Л . 617 нм и сравнивают с результатами спектрофотометрирования клеток, концентрация которого всегда
20 постоянна (0,01О/o). Мерой сорбции красителя клетками служит коэффициент распределения красителя между их поверхностью и средой, который расчитывают по формуле с.-с
С,у Vewc <
25 где Q — коэффициент распределения (величина безразмерная);
Co — концентрация исходного раствора альцианового синего, ед. оптич. плотности;
30 Cg-концентрация раствора после окрашивания им клеток, ед. оптич. плотности;
Vcr-объем клеточной суспензии, мл;
tz — количество в ней клеток;
Я„щ — объем внешнего примембранного слоя одной клетки, мл, который вычисляли по формуле:
Ъжс = ва е h, где S Ä вЂ” площадь внешних примембранных слоев (ВПМС), равная пло40 щади поверхности клетки; — толщина ВПМС„равная 1 мкм.
Пример 4. Клетки осцитной гепатомы
Зайделя получают от беспородных крыс весом 1.20 — 150 к, животных забивают, выде45 ляют асцит, наслаивают его на физиологический раствор 0,9О/р NaC1 при рН 7,4 и клетки 2 —,3 раза отмывают от асцитической жидкости, центрифугируя при 80 — 100 g.
После отмывки клетки ресуспензируют в физиологическом растворе, доводя концентрацию до 10 кл//мл. Дальнейшие операции производят аналогично изложенному в, примере 3.
В таблице приведены сравнительные результаты коэффициента распределения красителя между клеточной поверхностью клеток и средой при разных степенях повреждения клеток и при разных концентрациях окрашиваемых клеточных суспензий.
834435
Концентрация окрашива-с емой сусле нзии
10 кл/мл
Степень повреждения клеток по величине летальной дозы
Концентрация скрашиваемой суспензии
10 кМмл
Вид повреж пений
Абсошотные значения Я (безразмерная величина) Значени
Я % от койтро
Значения
Я„% от контроля
Абсолютные значения Я» (безразмерная величина) 100
Контроль 430+ 59
100 790 + 190
Летальная доза 37%
КУФ
ЙУФ
72 660 + 169
60 570 й110
300 + 213
258 «+123
72
Летальная доза 999Ь
172+ 117
150 и 113
40 368 + 147
35 400 + 147
К УФ
ДУФ
Немедленная гибель клеток
310+ 113
245 «+108
К УФ
128
30.100, 20 с 86 85
31
Трипсин
40 мин
86 + 186
Коэффициент распределения красителя между поверхностью клеток и средой.
Коротковолновое ультрафиолетовое излучение. и LIBHHHoBoHHosoe ультрафиолетовое излучение.
Как видно из таблицы, наибольшие значения коэффициента распределения красителя между поверхностью клеток и средой и, следовательно наибольшая сорбция альцианового синего поверхностью клеток были установлены для неповрежденных, (контрольных) клеток.
У клеток, облученных коротковолновыми и длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами в летальной дозе, снижающей опухолеобразующую способность клеток на 37%, значения коэффициента уменьшаются до
60 — 72% от значений коэффициента у неповрежденных клеток при окрашивании суспензии с концентрацией 106 кл/мл и до
72 — 84% при окрашивании суспензии с концентрацией 107 кл/мл. При облучении клеток обоими видами ультрафиолета в дозе, снижающей их опухолеобразующую способность на 99%, значения коэффициента уменьшаются до 35 — 40% и 47 — 51% при окрашивании суспензий в концентрациях 10 и
10 кл/мл соответственно.
Наименьшие значения коэффициента установлены для погибающих клеток, которые были необратимо повреждены воздействием высокой дозы коротковолновых ультрафиолетовых лучей, теплом или продолжительной инкубацией с трипсином.
Значения коэффициента распределения у погибающих клеток в случае окрашивания суспензий в концентрации 10 и 10 кл/мл составляют 10 — 30% и 11 — 39% от контроля соответственно. Следовательно, .наиболее сильное снижение сорбции альцианового синего происходит у погибающих клеток.
Предлагаемый способ позволяет рггистрировать по величине сорбции альцианового синего клеточной поверхностью степень (глубину) повреждения клетки, вызванного воздействием различных по своей природе агентов, причем такая регистрация возможна сразу по окончании воздействия повреждающего агента.
Способ позволяет значительно углубить представления о механизме повреждения клеток при действии ультрафиолетового излучения и показать участие деструктивных изменений клеточной поверхности в лучевом повреждении клеток. Кроме того, способ создает определенные предпосылки для расшифровки цитологического механизма повреждения клеток различным по своей физикохимической природе агентами, а не только ультрафиолетовым излучением, он позволяет диагностировать состояние поверхностных структур опухолевых клеток, которые в свою очередь обуславливают их способность к злокачественному росту.
834435
Формула изобретения
Составитель С. Малютине
Редактор С. Тараненко Техред А. Бойкас Корректор О. Билак
Заказ 4002/62 Тираж 907 Подлисное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и от крытий
113035, Москва, ж — 35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Способ определения повреждения клеток ультрафиолетовым излучением путем окрашивания их с последующей спектрофотометрией, отличающийся тем, что, с целью выявления ранних стадий повреждения, клетки окрашивают 0,01 — 0,015о о-ным раствором альцианового синего и по содержанию красителя, сорбированного на клеточной мембране, определяют стадию повреждения клеток.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Третьяков А. В. Изучение действия гистонов на опухолевые клетки. †(сЦитология», 1974, т. 16, № 4, с. 481 — 485.
