Способ получения изолимонной кислоты
Союз Советских
Соцнапнсткческии
Рес убп
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ
<11842106,Эв (61) Дополнительное к авт. сеид-ву— (22) Заявлено 291179 (21) 2844702/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет
Опубликовано 320681. Бюллетень No 24
Дата опубликования описания 300681
51 М Кдэ
С 12 P 7/48
Государственный комитет
ССС P но делам изобретений н открытий (53) УДК 661.734..16(088.8) (72) Авторы изобретения
Н.В. Шишканова, В.И. Илларионова., Т.В. Фино и A.Á. Лоэинов (j1) Заявитель
Институт биохимии и физиологии микрооргани
AH СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к способу получения изолимонной кислоты, используемой в медицинской
5 и химической промышленностях.
Изолимонная кислота используется как биохимический препарат, который закупается за рубежом по очень высокой цене — 152.000 валютных руб. за 1 кг (фирма "Se rva", CQlA, 1975), Высокая стоимость продукта определяется сложностью методов его химического синтеза и последующего выделения.
Известен способ получения изолимонной кислоты с помощью дрожжей
HansenuPa Subpe РЕ cu тоза (3FO 1458) на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода этиловый спирт (1). 20
Однако данный способ не обеспечивает достаточно высокого выхода изолимонной кислоты, ее выход от испопьзованного субстрата (60,0 г/л) составляет 23,3%.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения изолимонной кислоты путем культивирования ее продуцента-штамма Candida 1,тро fytiса 704 на питательной среде, со- 3() держащей парафины в качестве источника углерода, азота, фосфора и минеральные соли в условиях аэрации(2).
Цель изобретения — повышение выхода изолимонной кислоты. указанная цель достигается тем, что в способе получения изолимонной кислоты, предусматривающем культивирование ее продуцента-штамма Candida Pipo kytica 704 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, фосфора и минеральные соли в условиях аэрации, в качестве источника углерода используют зтанол .в концентрации 0,5-0,2%. Эту концентрацию этанола поддерживают путем его дробного введения в ферментационную среду.
Такое ведение процесса позволяет изменить соотношение синтезируемых дрожжами лимонных кислот в сторону преимущественного накопления изолимонной кислоты, что значительно облегчает процессы выделения этой кислоты из ферментационного раствора и последующей химочистки.
В предлагаемом способе используют штамм 704 коттзрый в связи с ор-, ганизацией Музея культур микроорганизмов в ИБФМ и передачей его в этот
842106 партию колб с посевной средой того же состава, объем инокулюма 5Ъ от объема среды.
Вторую партию колб также помещают на качалку и культивируют при
28-30 С в течение 48 ч. о
500 мл посевной культуры вносят в ферментационный аппарат с 4,5 л среды следующего состава, г/л: (й Н4 4. 5 04 2,4
HgS04 7 Н 0 1,4
NaC К 0,5
Са (йОЭ) т 0,8
КН РО4 2,0
К HPO 0,2
Этанол 200 (вносится дробно)
Соль Мора 3,5 мг
Тиамин 500 мкг институт зарегистрирован как Cand i—
da fi роfyt i са ИБФМ у-160.
Пример 1. Дрожжи Candida
tipo kytica 704 (в коллекции института ИБФМ У-160) поддерживают на агаризованной минеральной среде Ридер, имеющей следующий состав, г/л: (NH4)2 504 3,0
М9504 - 7 Hg O йаС В 0 5
Са (йод )2 0,4
КН РО4 1,0
К НРО4 0,1
Этиловый спирт 10,0
Агар-агар 25,0
Дрожжевой автолизат 2,0 мл
Смесь микроэлементов по Буркгольдеру 5 мл
Смесь микроэлементов по Буркгольдеру включает компоненты, мг/л cpeFe 0,05, Дрожжи выращивают на скошенном
arape в течение 3 сут при 28-30 С.
Клетки смывают 5 мл стерильной водопроводной воды, и суспензию переносят в колбу объемом 750 мл, содержащую 50 мл питательной среды.
Среда для выращивания посевного материала имеет следующий состав, г/л: (йН4 )г 504 0 3
И9504 . 7 Н О 0,7 йаСЕ 0,5
Са (NOg ) g 0,4
KH@PO4 1,0
К2НРО4 0,1
Этиловый спирт 10,0
Тиамин 500 мкг
Смесь микроэлементов 5 мл
Выращивание проводят в течение
48 ч на качалке (260 об/мин) при
28-30 С. Полученную посевную кульО туру переносят в новую партию колб 45 со средой того же состава в количестве 5Ъ от объема среды. Через 5 сут культивирования в среде накаплнвается 6,0 r изолимонной и 1,5 r лимонной кислоты. в 1 л. Выход изолимонной кислоты составляет 60Ъ от веса использованного субстрата. Соотношение лимонной и изолимонной кислот 1:4 ,П, р и м е р 2. Выращивание культуры Candida kipo fytica ИБФМ У-160 на с кошенном агаре проводят, как опискино в примере 1. Клетки смывают 5 мл стерильной водопроводной воды,.и суспензию переносят в колбы на 750 мл с 50 мл питательной среды. Состав среды такой же, как в примере 1.
Через 48 ч инкубации полученную посевную культуру переносят в новую
ВНИИПИ Эаказ 4982/25 Ти
Филиал П1111 Патент, г, Формула изобретения
Способ получения изолимонной кислоты путем культивирования ее продуцента-штамма Candida fiро tyti— са 704 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, фосфора и минеральные соли в условиях аэрации, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода
55 целевого продукта, в качестве источника углерода используют этанол н концентрации 0,5-2,0Ъ.
Источники информации, принятые во внимание при экопертизе
1. Патент Англии N 1199700 кл. С 2 С, опублик. 1970.
2. Авторское свидетельство СССР
9 305187, кл. С 12 D 1/04, 1968.
Пеж 528 Лодпноное
Уетопод, ул. Проектная,4
Смесь микроэлементов 10 мл
2O Bo eM e MeHTaUHH pH среды поддерживают на уровне 6,0 путем введения 10Ъ NaOH, концентрацию кислорода поддерживают на уровне
70-80Ъ насыщения, температуру 28-30 С.
Концентрацию -этанола поддерживают на уровне 5-20 г/л. Если она снижается, до 5 г/л, добавляют еще этанол, но так, чтобы его концентрация в среде не превышала 20 г/л.
Через 138 ч культивирования в среде накапливается 66,0 г/л изолимонной кислоты (31,0 г/л лимонной кислоты); выход кислоты составляет
66,0Ъ от веса использованного субстрата. Соотношение лимонной и изолимонной кислот 1:2.
Таким образом, проведение фермен- тации по предлагаемому способу изменяет соотношение накапливаемых лимонных кислот в сторону преимущест40 ненного накопления изолимонной, повышая ее выход, и тем самым облегчает процесс выделения кислоты из ферментационного раствора и последующей химочистки.
