Биоспецифический сорбент для выделения l-аспарагиназы из клеток e. coli и способ выделения l-аспарагиназы с применением этого сорбента

 

1. Биоспецифический сорбент общей формулы где P - остаток агарозы, для выделения L-аспарагиназы из клеток E.coli.

2. Способ выделения L-аспарагиназы из клеток E.coli аффинной хроматографией путем сорбции на биоспецифическом сорбенте с последующей промывкой сорбента буферным раствором и элюированием фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве биоспецифического сорбента используют соединение общей формулы где P - остаток агарозы, и элюирование фермента ведут 0,02 - 0,03 М раствором L-аспарагина в 0,05 - 0,1 М фосфатном буферном растворе при рН 7,0 - 8,0. Предлагается биоспецифический сорбент для выделения биологически активных белковых ферментов, а именно биоспецифический сорбент для выделения L-аспарагиназы из клеток E. coli общей формулы P-O-NH-(CH₂)₁₀-NH--CH₂- где P остаток агарозы, и способ выделения L-аспарагиназы с помощью указанного сорбента. Известен биоспецифический сорбент для выделения L-аспарагиназы из клеток E. coli общей формулы P-O-NH-(CH₂)₆-NH- где P остаток агарозы. Выделение L-аспарагиназы аффинной хроматографией с помощью указанного фермента ведут путем сорбции растворов фермента. Сорбент промывают буферным раствором. Элюцию осуществляют 0,05 М натрийборатным буферным раствором, содержащим 0,3 М NaCl. Недостатком известного сорбента является его нестабильность, одноразовость использования; активность полученного продукта невысокая. С целью устранения указанных недостатков предлагается биоспецифический сорбент для выделения L-аспарагиназы из клеток E. coli общей формулы P-O-NH-(CH₂)₁₀-NH--CH₂- где P остаток агарозы. Выделение L-аспарагиназы аффинной хроматографией с помощью указанного сорбента ведут путем сорбции экстракта фермента. Сорбент промывают буферным раствором. Элюцию фермента ведут 0,02-0,03 М раствором L-аспарагина в 0,05-0,1 М фосфатном буферном растворе при рН 7,0-8,0. Способ позволяет получать целевой продукт высокой активности. Синтез биоспецифического сорбента проводят по схеме
a) P+ __→ PC NH
б) PC NH+H₂N-(CH₂)₁₀-NH₂
__→ H₂
в) P-O-NH-(CH₂)₁₀-NH₂+CF₃-CO-NH-<img src="https://img.findpatent.ru/img_data/779/7796310.gif">
-NH-CO-CH₂-OH _→
В качестве полимерной матрицы используют агарозу фирмы Farmacia Fine Chemicals (Швеция). 20 мл геля агарозы активируют бромцианом (0,2 г BrCN на 1 мл агарозы) при рН 11,0 и присоединяют декаметилендиамин (0,2 г на 1 мл агарозы) при рН 9,8. Диамин, не вошедший в реакцию, отмывают и добавляют 10 мл раствора 0,5 г N α -трифторацетил- α -метилового эфира L-аспарагиновой кислоты в диметилформамиде при рН 4,7. При перемешивании добавляют раствор 1,0 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида в 5 мл воды, рН суспензии поддерживают добавлением 1 н раствора соляной кислоты (7). Гель агарозы отмывают диметилформамидом и водой, затем для отщепления защитных групп суспензию перемешивают с 200 мл 0,2 н раствора едкого натра (16), отмывают водой и хранят при 4^оС. Для определения содержания иммобилизованного ингибитора в биоспецифическом сорбенте суспензию сорбента гидролизуют 6 н раствором соляной кислоты при 110^оС в течение 16 ч. Аминокислотный анализ гидролизата дал концентрацию иммобилизованного ингибитора [L-ингибитора] 7,8˙10^-3 М. П р и м е р 1. 65 мл экстракта из клеток E. coli с удельной активностью 2,59 МЕ/мл пропускают через колонку (1,0 х 18 см), в которой находится 18 мл биоспецифического сорбента, полученного описанным способом из 20 мл агарозы. Колонку последовательно промывают 50 мл 0,05 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0); 300 мл 0,3 М раствора KCl в том же буфере; 70 мл 10%-ного раствора диметилформамида в том же буфере; 60 мл 0,5 М раствора KCl в том буфере и 100 мл 0,3 М раствора KCl в том же буфере. L-Аспарагиназу элюируют 0,03 М раствором L-аспарагина в том же фосфатном буфере, содержащем 0,3 М KCl. Регенерацию сорбента осуществляют промывкой сорбента 8 М раствором мочевины в том же буфере, затем исходным буферным раствором. Данные примеров сведены в таблицу. Молекулярная масса выделенной L-аспарагиназы, определенная методом седиментационного равновесия, равна 139000 ± 4000. Определенная изоэлектрическая точка L-аспарагиназы (pI) 5,20±^0,06хорошо согласуется с известными значениями (pI) 5,22±0,04 для L-аспарагиназы из E. coli. Выделенная L-аспарагиназа по удельной активности (234-251 МЕ/мг белка) не уступает ферменту, выпускаемому фирмой "Bayer" (ФРГ) с активностью 220 МЕ/мг белка (5), при этом степень одноразовой очистки достигает 633-733 раза. Одновременно заявляемый способ выделения L-аспарагиназы характеризуется высоким выходом (до 71%).

Формула изобретения

1. Биоспецифический сорбент общей формулы

где P остаток агарозы,
для выделения L-аспарагиназы из клеток E.coli. 2. Способ выделения L-аспарагиназы из клеток E.coli аффинной хроматографией путем сорбции на биоспецифическом сорбенте с последующей промывкой сорбента буферным раствором и элюированием фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве биоспецифического сорбента используют соединение общей формулы

где P остаток агарозы,
и элюирование фермента ведут 0,02 0,03 М раствором L-аспарагина в 0,05 0,1 М фосфатном буферном растворе при рН 7,0 8,0.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000

Извещение опубликовано: 27.12.2000        

---