Способ получения окрашенных суб-ctpatob для определения протеолитичес-кой активности

 

Союз Советских

Социалистических

О П И С А Н И Е ()830723

ИЗОБР ЕТЕ Н И Я

К АВТОРСКОМУ СВМДЕТЕЛЬСТВУ

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 27.02.79 (21) 2771526/23-04 (51) М Кл з С 07 G 7ф22 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллетень Л" 9 (45) Дата опубликования описания 10.03.81

Государственный комитет по делам изобретений и открытий (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) (72) Авторы изобретения P. В. Пятнюнас, Г. И. Денис, В. В. Карпавичюс, М. В. Данилевичюте, Ю. Ю. Степонавичюс, А.-С

И. И. Кюдулас и В. И. Лауцюс (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский ин прикладной энзимологии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКРАШЕН

СУБСТРАТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

П РОТЕОЛ ИТИ Ч ЕСКО и АКТИ В НОСТИ ку белка диазониевой солью в щелочной среде (рН) и последующее выделение целевого продукта при подкислении реакционной массы соляной кислотой.

Известный способ получения окрашенных субстратов для определения протеолитической активности (1) включает обработ- 10

ОН

Е,) I

Изобретение относится к улучшенному способу получения окрашенных субстратов для определения протеолитической активности соответствующих ферментов, который может найти применение в биологии, медицине и сельском хозяйстве. где Б — белок;

Аг — ароматический или гетероциклический радикал.

Однако с диазониевыми солями легко реагируют и свободные аминогруппы белка, входящие в остатки лизина. При этом образуются нестабильные и слабо окрашенные

Окрашивание белков диазониевыми солями происходит, в основном, вследствие взаимодействия с последним остатков гистидпна и тирозина, с образованием интенсивно окрашенных азосоединений (2) ОН

N=N — Л1

Б

) -N=N — Av

1

Я триазеновые и пентазеновые соединения.

Онн почти не увеличивают степени окрашиванпя субстрата, и в то же время, приводят к уменьшению его стабильности. Кроме того, протекает реакция дезаминирования лизиновых остатков. Образуются ароматические амины, которые реагируют с диазо810723

;-тт,х я-ын i,,--ттн-,тт=тт-Ar — Bicu ттт-6;-т - ;.4

АМ",Х

4 — МН A NKX AP-NH-N=3 -AP ниевой солью, превращаясь в побочные низкомолекулярные окрашенные диазоамиЭти нежела гсльные реакции затрудняют очистку субстрата и ухудшают его качество, из-за чего уменьшается точность определения протеолитической активности фермента.

Целью изобретения является повышение качества продукта.

Поставленная цель достигается описываемым способом, заключающимся в том, что перед обработкой белка диазониевой солью проводят модификацию свободных аминогрупп белка ацилирующим или алкилирующнм реагентом.

При этом, во время реакции с модттфпцирутощим реагетттом, более 90% свободных аминогрупп белка модифицируются, а в реакцию с диазониевой солью вступают, в основном, только гистидиновые и тирознновые остатктт.. белка, образуя моноазопроизводные.

Стандартная мстодика прттготовления раствора диазониевой соли для обработки белков: ароматический амин растворяют при .перемсшивании в эквимолярном количестве 0,1 н. NaOH, добавляют эквимолярное количество азотистокислого натрия и охлаждают до 0 — 5 С. Прибавляют по каплям, при перемешивании 1 и. HCi, с расчетом 4 — 5 лтоль на 1 лтоль амина и выдерживают при температуре 0 — 5 С в течение

30 Мин. Получетптый раствор непосредственно используют для окрашивания белков.

Пример 1. В 100 лл 15%-ного водного раствора СН СООХа растворяют 5 г альбумина (оычьей сыворотки) и при температуре 0 С, перемешивая, добавляют

15 лл уксусного ангидрида. По истечении

1 ч модифицированный альбумин осаждают, подкисляя реакционную смесь при помощи 1 н. НС! до рН 3. Осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, влажный продукт растворяют в 100 мл 0,05М боратного буфера (рН 9,3), раствор охлаждают до 0 — 5 С и, перемешивая, обрабатывают раствором диазониевой соли, полученным из 0,52 г сульфаниловой кислоты. Реакцию проводят, энергично перемешивая при температуре

0 — 5 С в течение 30 яин, рН поддерживают при помощи 1 н. NaOH в пределах 8,5 — 9,0.

Продукт осаждают при помощи 1 н. НС1, понижением рН до 3. Осадок отделяют центрифугированием, очищают переосаждением из щелочного раствотэа и лиофилизируют. Получают 4,0 н. субстрата в виде оранжевых пластинок, хорошо растворимых

55 носоедипештя, трудно отмываемые от целевого про.тукта: в воде при рН--5. Молярный коэффицнс„э. стинкции при 340 нтт, рН 7,2 — 85000, при

-:.00 нл, рН 7,2 — 50 000, (принимая молекулярную массу белка равной 70 000) .

Пример 2. В 100 лл 5,0 М раствора солянокислого гуанидина растворяют 5 г казеината натрия, добавляют 10 г сукцинилангидрида; рН поддерживают в преде.".ах 9 — 10 при помощи 1 н. ХаОН. Реакнню проводят в течение 30 ттин, Прибавляют 7 г солянокислого гидроксиламина, рН доводят до 10 и оставляют при комнатной температуре в течение 60 иин. Продукт осаждают подкисленисм 1 н. НС! до рН 3, осадок отделяют центрпфугированием и растворяют в 100 лл 0,05 М боратного буфера. Раствор охлаждают до 0 — 5 С и добавляют раствор диазониевой соли, приготовленный из 0,52 г ортаниловой кислоты; рН раствора поддерживают при помощи 1 и. NaOH в пределах 9,0 — 9,5. Реак;ию проводят в течение 15 лтин. Продукт о;аждают подкислением при помощи 1 н.

HCI,то рН 3 и отделяют центрифугироватшем. Надосадочную жидкость удаляют, продукт очищают переосаждснием из щелочного раствора, осадок промывают 100 ял воды, 100 я.г этанола и сутпат в вакуумэкснкаторе одни сутки. Получают 3,8 г коричневого порошка, растворимого в слабо шелочном водном растворе. Молярный коэффициент экстинкции при 340 нль рН 7,2—

115 000, при 400 нлт, рН 7,2 — 75 000 (принимая молекулярную массу белка равной

30 000) .

Пример 3. В 100 лтл 0,05 М боратного буфера растворяют 3 г казеина, подщелачттвают при помощи 1 í. NaOH до рН 11, r:рпбавляют 0,3 г акрплонитрила и выдерживают при комнатной температуре в течепис 10 — !5 ч. Доводят рН до 9,5 и приливают раствор диазониевой соли, полученный из 0,37 г амино-Г-кислоты, рН поддерживают при помощи 1 и. NaOH в пределах 9,0 — 9,5. Реакцию проводят в течение 60 чан при температуре 0 — 5 С. Выделение и очистку продукта проводят аналогично примеру 1, Получают 2,4 г окрашенного с тбствата в виде красных пласстинок, хорошо растворимых в воде при р1- = .""" -тй <оэффициент экстинкции тт т 250 т °, т Н 7,2 — 100000, птти 4(т0 ня, пН 2 — 90 000 (пттинимая молекулярную масл o .""a чавттой 30 000).

П" " м" 4. В 100 ттл 0,05 М боратного б A" "твоттяют 5 г казеината на810723 трия, подщелачивают при помощи 1 н.

NaOH до рН 11, прибавляют 1,0 г акриламида и выдерживают при температуре

50" С в течение 8 — 10 ч. Реакционную смесь охлаждают до 0 — 5 С, рН доводят при помощи 1 н. МаОН до 9,5 и прибавляют раствор диазониевой соли, приготовленный нз 0,52 г сульфаниловой кислоты. Время реакции 15 мин, температура 0 — 5 С, рН

8,5 — 9,0. Продукт выделяют и очищают аналогично примеру 2. Получают 3,5 г коричневого порошка, хорошо растворимого в слабо щелочном водном растворе. Молярпый коэффициент экстинкции при 340 нм, рН 7,2 — 13 000, при 400 нм, рН 7,2 — 80000 (приш.мая молекулярную массу белка равной 30 000)1.

Пример 5. В 100 мл 0,05 М боратного буфера растворяют 3 г альбумина (бычьей сыворотки), добавляют 1 н. IIIaOH до рН 10, прибавляют 1,5 мл 307о-ного раствора метилвинилкетона и выдерживают в течение 4 ч при комнатной температуре.

Доводят рН до 9,5 и прибавляют ратвор диазониевой соли, приготовленный из 0,44 г н-арсаниловой кислоты, рН раствора поддерживают в пределах 8,5 — 9,0, температуру 0 — 5 С. Реакцию проводят в течение 15 мин. Продукт выделяют и очищают аналогично примеру 1. Получают 2,3 г продуктов в виде красных пластинок, хорошо растворимых в воде прп рН ) 5. Молярный коэффициент экстинкции при

340 нм, рН 7,2 — 115000, при 400 нм, рН

7,2 — 70 000 (принимая молекулярную массу белка равной 70 000).

Пример 6. Приготовление раствора диазониевой соли из сульфаниловой кислоты:

В 30 мл 0,1 í. NaOH растворяют 0,52 г (0,003 моль) сульфаниловой кислоты, добавляют 0,21 г (0,003 моль) азотистокпслого натрия и охлаждают до температуры

0 — 5 С. К полученному раствору по каплям, при перемешивании добавляют 15 мл

1 и. НС! и выдерживают при температуре

0 — 5 С в течение 30 мин.

Аналогичным путем были получены растворы диазониевых солей из ортаннловой, арсаниловой кислот и амино-Г-кислоты, которые в дальнейшем былп использованы для обработки (окрашивания) растворов модифицированных белков.

Модификация аминогрупп белков перед окрашпванием обеспечивает следующие преимущества: модификация препятствует образовани!о лабильных триазеновых и пентазеновых связей, в результате чего повышается стабильность субстрата, исключается расходование диазониевой соли на образование соединений с низким коэффициентом экстинкции, за счет чего повышается выход интенсивно окрашенных групп типа азогистидина и азотитрозина; модификация снижает выход побочных окрашенных соединений, поэтому облегчается очистка целевого продукта и понижается фоновая окраска субстратов, опти5 ческая плотность контрольных растворов гри определении протеолитической активности составляет 0,01 и ниже; повышается точность определения про- =-олптнческой активности; !

О модификация улучшает механические свойства субстрата, что позволяет снизить время центрифугирования. В отдельных случаях возможно применение фильтрации, что упрощает процедуру очистки. !

Определение растворимости субстратов.

0,500 г субстрата заливают 50 мл 0,1 М универсального буфера (рН 7,2), смесь пе35 ремешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре (20" С). Определяют время, необходимое для полного растворения субстрата.

Результаты приведены ниже.

Субстрат

II

III

Время, мин

45

Определение степени окрашивания. Готовят 0,025"1о-ные растворы субстратов в

0,1 М универсальном буфере (рН 7,2).

Измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре СФ-26, при длине волны 400 нм, против буферного раствора (толщина кюветы 10 мм).

Результаты приведены в табл, 1.

Таблица ! 3111 OC Hтс.1ьпая степень ократт1пва1И1Я

Опт1п1ссиая плотность

0,025 -ного раствора субстрата при

1.=400 н.ч

1 !.00

0.98

0.50

0,82

О,!3

О,!3

Проведена сравнительная оценка 3 образцов субстратов:

Субстрат I — окрашенный казеин, изготовленный по предлагаемому способу.

20 Субстрат I! — окрашенный казеин, изготовленный по способу-прототипу.

Субстрат 111 — азоказеин фирмы «Серва» (ФРГ).

Для всех образцов определены 5 показателей: растворимость, степень окрашивания, относительная чувствительность при определении протеолитической активности, фоновая окраска контрольных проб при определении протеолитической активности, стабильность.

810723

Определение относительной чувствительности при определении протеолитической активности с использованием различных субстратов.

Таблица 3

В пробирку вливают 2 мл 1%-ного раствора субстрата в универсальном буфер:. (рН 7,2), помещают в ультратермостат при

30 С и выдерживают в течение 8 — 10 ман.

Добавляют 2 м г раствора фермента (2,5 !0 мг/лл протосубтилина ГЗх), термостатированного при 30" С, Точно через 10 мин добавляют 4 мл 10 -ного раствора трихлоруксусной кислоты, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить непрогидро- 15 лизованный субстрат. Быстро перемешивают и выдерживают при 30 С в течение

10 мин. Затем реакционную смесь фильтруют через плотный фильтр (синяя лента) .

Измеряют оптическую плотность фильтрата 20 па спектрофотометре СФ-26 против контрольной пробы при длине волны 400 нм.

1 0,0 1 0 !

1 0.043 ! I1, 2.008

О,! 0

0,54

0,62

Контрольную пробу готовят параллельно с опытным гидролизатом. Для этого в 25 пробирку вливают 2 мл ферментного раствора, добавляют 4 мл раствора 10%-ного трихлоруксусной кислоты, выдерживают в ультратермостате при 30 С в течение

10 агин, затем в пробирку вносят 2 мл раствора субстрата, выдерживают при 30 С в течение 10 мггн и фильтруют через плотный фильтр (синяя лента) .

Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 4

Т а о, itr II aa 2

0-: -ocH. телы ая чувстви; С lbl!OCTb

Оптическая плотность г.оров прп опреде лсиип активности"

F» са

Я

1

» о после 5 ч ири 100 С без . аг",евания

1,60

1 (II

1 0012

0,413

G,020

0,79

0.326

0,096

0,23

Способ получения окрашенных субстратов для определения протеолитической активности, путем обработки белка диазоние40 гой солью в щелочной среде с последующим выделением целевого продукта, о тл и. ч а ю шийся тем, что, с целью повышения качества продукта, перед обработкой белка диазониевой солью его подвергают

45 взаимодействию с ацилирующим или алкилирующим реагентом. " Среднее значение нз 5 определений.

Определение феновой окраски контрольных проб.

В пробирку вносят 2 мл 1%-ного раствора субстрата в универсальном буфере (рН 7,2), добавляют 2 мл воды и 4 мл

10 -ного раствора трихлоруксусной кислоты. Перемешивают и выдерживают в течение 10 мин при 30 С. Фильтруют через плотный фильтр (синяя лента) и измеряют оптическую плотность фильтрата при

Х = 400 нм на спектрофотометре СФ-26 против ее смеси, но не содержащей субстрат.

Результаты приведены в табл. 3.

О,: ьческая !Iлотность контрольнык проб

1 ..1 (:; сительиая" "

" Среднее значение из 5 измерений.

В ого iio отношепьпо к оптической плотности

0,25 0-ного раствора соответствуюгцего субстрата.

Определение стабильности субстратов.

Образцы субстратов выдерживают в термостате при 100 С в течение 5 ч. Готовят

1%-ные растворы субстратов в универсальном буфере (рН 7,2). В пробирку вливают

2 гид 1%-ного раствора субстрата, добавляют 2 мл воды и 4 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Выдерживают в течение

10 мин при 30"С, фильтруют через плотный фильтр (синяя лента) и измеряют оптическую плотность субстрата на спектрофотометре СФ-2б, против аналогичной смеси, не содержащей субстрата. Параллельно проводят контрольные опыты, осаждая субстраты, не подвергнутые нагреванию.

Результаты приведены в табл. 4.

0 lòè÷bñêlÿ ilëoãèîñ-: 4ильтратов"!

1: 0047 0.088

П I j 0,011, 0,015

Среднее значение пз 5 определений.

Формула изобретения

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе;

810723

Составитель H. Волкова

Техред Л. Куклина

Редактор H. Потапова

Корректор И. Осиновскаи

Заказ 217/228 Изд. ¹ 217 Тираж 419 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35. Ратшская наб., д. 4/5

Тип. Харьк фил. пвед. «Патент»

1. Суринов Б. П., Манойлов С. Е. Определение активности протеолитических ферментов с помощью азоказеина. Вопросы медининской химии, 1965, XI, № 5, 55 (прототип) .

2. Howard А. М., Wild F., The Reactions

of Diazonium Compounds with Amino Acids

and Proteins, Biochem. J. 1957, 65, 651.