Способ получения белковых субстра-tob для определения протеолитическойактивности

 

О П И С А Н И Е »ЗЮ722

ИЗОБР ЕТЕ Н И Я

СОЗРа Cl_#_EI CkKX

Секкамнстаческкх

Реааублдк

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свпд-ву— (22) Заявлено 15.08.78 (21) 2653395/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. К..

С 07 6 7/02

Гесудараикньй кем ать

CCC P ю двим ese6parweQ (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллетень № 9 (53) УДК 547.15.07 (088.8) w аткритнй (45) Дата опубликования описания 07.03.81 (72) Авторы изобретения

Савицкен

Ф институг

Г. И. Денис, М. В. Данилевичюте, P. Ю и Ю. Ю. Степонавичюс

j3 1 Г, р" 1 у-,: (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский прикладной энзимологии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВЫХ

СУБСТРАТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

1

Изобретение относится к области биохимии, в частности к энзнмологии, и может быть использовано для определения протеолитической активности с применением в качестве субстратов модифицированных белков, свободные аминогруппы которых заблокированы путем химической модификации. Полученные данным способом субстраты особенно пригодны для определения протеолитической активности по скорости образования аминогрупп, так как начальное содержание аминогрупп близко к нулю.

Известен способ получения белковых субстратов, включающий блокирование аминогрупп 11).

В известном способе. блокирование аминогрупп )cJIKoB (казеина, желатины, гемоглобина) проводят восстановительным метилированием путем действия натрийборгидридом и формальдегидом на исходнйе белки. Однако, получаемые таким путем модифицированные белки имеют высокую стоимость. Кроме того, метилирование делает белок более гидрофобным, вследствие чего может уменьшаться его растворимость в в.оде.

Целью изобретения является удешевление субстратов и улучшение их растворимости в воде.

Поставленная цель достигается тем, что блокирование аминогрупп белков проводят действием акриламида в водной среде при

45 — 55 С и рН 10 — 11, обычно применяя

20 — 30% акриламида от веса модифицируемого белка. При этом аминогруппы белков присоединяются к этиленовой связи акриламида, в результате чего водородные атомы аминогрупп замещаются карбамидо

10 этильными группами:

СН,= CHCONH

5NH — э- Б — ХН

СНг — — СНСОХН

15 — СН вЂ” СНаСОКНа — - — - Б — N (С На — С Н вЂ” CON Hg) g где Б — остаток белка (казеина, яичного альбумина и др.) .

20 Для проведения модификации обычно готовят суспензию белка в воде. Добавляют щелочь и перемешивают при комнатной температуре до полного растворения, после этого доводят рН раствора до 10 — 11. При25 бгвляге г 20 — 30% акриламида от веса модифицируемого белка и выдерживают раствор при 45 — 55 С в течение 5 — 12 ч в зависимости от температуры, рН и модифицируемого белка. После этого охлажда30 ют до комнатной температуры и нодкисля8

3 ют. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, насадочную жидкость удаляют, а осадок суспендируют в воде, растворяют добавлением щелочи и осаждают разбавленной соляной кислотой. Осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, а осадок промывают водой и высушивают лиофилизированием.

Пример l, В ббО мл воды суспендпруют

40 r казепната натрия (ч) „добавляют

О,"--0,3 мл 1ii. Ua011, перемешивают при комнатной температуре до полного растворения, доводят раствор до рН 11 при по InIIIII II. NaOlI. Прибавляют 11,7 г акриламида (ч) и выдерживают раствор при

50 С в течение 10 ч, реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, подкисляют, добавляя по каплям 10", о HCl до рН 2 — 3. Выпавший осадок отделя|от центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют, а остаток растворяют, добавляя по каплям к 200 мл образовавшегося раствора 1 н. NaOH и осаждают, добавляя 10 /о НС1 до рН 2 — 3. Полученную смесь центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок высушивают лиофилизированием. Получают 27 г белка порошка.

Пример 2. В 250 мл воды добавляют

10 r яичного альбумина и растворяют при перемешивании. При помощи lн.. NaOH доводят рН до 10. Прибавляют 3 r акриламида и выдерживают раствор при 50 С в течение 7 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, подкисляют добавлением 10 /о IC1 до рН 4 — 5. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, а осадок суспендируют в 100 мл воды, раст. ьоря1о, добавляя по каплям 1 н. МаОН 1 осаждают, добавляя 10 /о НС1 до рН 4 — 5, ?1олученную смесь центрифугируют. Надо с:I. 0 Iíóio жидкость удаляют, а осадок высушивают лиофилизированисм. Получают

7 г белого порошка.

Пример 3. Методика определен гя протеолитической активности. В две пробирки вместимостью 20 — 25 мл наливают 1 мл

0.5 /о-ного раствора выше OII III aiiiiîãî субстрата в 0,1 М универсальном буферс, рН

7,2 и термостатируют в ультратермостаг прп 30 С 5 мнп. В одну пробирку приливают 1 мл ферментного раствора в универсальном буфере, рН 7,2, а в другую—

1 мл инактивированного ферментного рас1вора (контроль) и инкубируют при 30 С

10 мин, после чего переносят обе пробирки в кипящую водяную баню и выдерживают в ней 5 мин. В охлажденные до комнатной температуры пробирки с инкуба 1ионной смесью прилипают по 9,4 мл обрат11ого буфера, рН 9,3 и по О,б мл 0,03 М 1 аствора 2, 4, б-тринитробензолсульфокислоты, энергично взбалтывают реакционную смесь и выдерживают в термостате при 30 С!

0722

40 мин, после чего определяют оптическую плотность опытного раствора на фотоэлектроколоримстре ФЭК-56М (4 фильтр) или на спектрофотометре при 420 нм против контрольной пробы (с инактивированным ферментом) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Протеолитическую активность (ПЛ) вычисляют по формуле:

10 Д 12

ПА = 1000 мг экв/чпн, ГЭ 10. ч где Д вЂ” оптическая плотность:

12 — разведение ферм HTHolo раство15 ра в ходе определения;

ГЗ вЂ” глициновый эквивалент, определенный IIO градупровочной кривой;

10 — время гидролиза субстрата, мин; м — колцчсство фсрментного препарата, взятого на протеолиз, мг/мл;

1000 — переводной коэффициент полученных единиц на 1 г фсрмснт25 ного препарата.

Результаты определения. По вышеуказанной методике проведены 4 серии определений протеолитпческой активности. Pзультаты приведены в таблице

20

Коэффициент вариан|и /о, ПЛ 100/

Срсднсс аначенис пл о о

5 о о 1 г. о о

У о

Дисперсия, 1s21

2, 3

1,4

1,5

1,2

1,4

677

63О

594

86.4

79,3

56,0

67,3

1О

1О

1О

1О

60 Формула изобретения

1. Способ получения белковых субстратов для определения протеолитической активности путем блокирования аминогрупп белков, отличающийся тем, что, 40

Блокирование аминогрупп акриламидом обеспечивает следующие преимущества.

1. Получают субстраты намного дешевле изготовляемых за рубежом модифици45 poBBHFIbIx восстановительныч метилированием белков. Например, стоимость 1 г метилказеина фирмы «Серва» (ФРГ)

12,8 валютных рублей 1 категории, а ориентировочная цена казеина, модифициро5о ванного акриламидом, 0,5 — -1,0 руб. за 1 кг.

2. Изготовление субстраты обладают хорошими физико-химическими свойствами. При модификации белков акриламидом вводят полярные С IqCHCONH> груп55 пы и таким образом улучшается растворимость в воде. Это позволяет быстро приготовлять растворы модифицированных белков в широком диапазоне концентрацией.

8!0722

Составитель Г. Коннова

Техред А. Камышникова

Редактор Л. Курасова

Корректор О. Силуянова

Заказ 2151

Тираж 419 Изд. № 235

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д 4!5

Подписное

Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлиснолком с целью удешевления субстратов и улуч<псния их растворимости в воде, блокиро:вание аминогрупп проводят действием акриламида в водной среде при 45 — 55 С и р«-! 10 — 11.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, применяют 20 — 30 /о акриламида ,от веса модифицированного белка. с

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Л. Lin, G. Е. Means and К. Fecn«y

«The action of proteolytic enzymes on

N, N — dimetil proteins» Л. Biol. Chem.

244, 789 †7, 1969 (прототип).