Реактив для определения формиата или соединений, переходящих в формиат

 

Союз Советских

Социалистических республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

<>860718 (61) Дополнительный и патенту (22) Заявлено 120178 (21) 2563049/23-04 (53)М. Кл. (23) Приоритет - (32) 18 ° 03 ° 77

G 01 N 33/54

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (31) P 2712004. 3 (33) ФРГ (53) УДК 543.432 (088.8) Опубликовано 300881.Бюллетень ¹ 32

Дата опубликования описания 30088,1 (72) Авторы Иностранцы изобретения Герхард Михаль, Рольф Лаубе ер " (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОРМИАТА

ИЛИ СОЕДИНЕНИЯ, ПЕРЕХОДЯЩИХ В ФОРМИАТ

Формиатдегидрогеназа из Candida

Ьоidinii

Никотинадениндинуклеотид лития

Динатрийфосфат

Мононатрийфосфат

Вода

0,001-0,1

0,007-0,7

0,153-3,1

0,01-0,20

Остальное

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к составам для определения формиата или соединений, переходящих в формиат.

Известен реактив для определения формиата или соединений, переходящих в формиат, на водной основе, содержащий аденозинтрифосфат и тетрагидрофолиев ую кислоту (1 ).

Недостатком указанного реактива является его низкая эффективность.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является реактив для определения формиата или соединений, 1з переходящих в формиат, на водной основе, включающий аденозинтрифосфат, триэтаноламин, хлорид магния, ацетат натрия, гидроокись калия и тетрагидрофолиевую кислоту (21. 20

Недостатком известного реактива для определения формиата или соединений, переходящих в формиат, является также его низкая эффективность.

Цель изобретения — повышение эффективности реактива.

Поставленная цель достигается тем, что реактив для определения формиата или соединений, переходящих в формиат, на водной основе, дополни- .30 тельно содержит формиатдегидрогеназу из Candida Ьоid ini1 никотинадениндинуклеитид лития, динатрийфосфат,и мононатрийфосфат при следующем соотношении компонентов, вес.Ъ:

Пример 1 ° А; Получение фермента.

400 r Candida Ьоidinii, культивируемого на метаноле, в глубокозамороженном состоянии размораживают в

1200 мл 50,ц М раствора аммонсульфата и держат в нем 1 ч при 37 С. Поо том рН суспензии устанавливают с помощью 10%-ного раствора полиэтиленамина на значении 7,5. Осадок центрифугируют, выдерживают в 9%-ном по объему растворе фосфатгеля с рН 7,5 и спустя 30 мин центрифугируют. После промывания 0,5 М раствором йаС! гель экстрагируют с помощью 0,2 М фосфатного 6vAeoa с

860718 рН 7,5. Экстракт помещают н 3,2 M раствор аммонсульфата, причем рН поддерживается равным 7,5. Образованный осадок отделяют и после растворения в фосфатном буфере (рН 7,5) хроматографируют через ДЕАЕ-целлюлозу (целлюлоза, модифицированная соединением диэтиламиноэтанола), причем .элюирование осуществляют с увеличением концентрации буфера фосфата с рН 7,5. Содержание ФДГ фрак-. ции объединяют, вновь вносят на

3,2 М раствор аммонийсульфата, оставляя рН постоянным. Осадок отделяют, растворяют в фосфатном буфере с рН 7,5 и после диализа обрабатывают гидроксилапатитом. После отделения гидроксилапатита раствор лиофилизируется.

Выход 0,7 r лиофилизата со специфической активностью около 3,5/мг протеина. Общий выход составляет 43%.

Б. Определение формиата.

0,02 мл 0,100 М водного НАД-раствора, 0,02 мл 2,5,о М растнора формиата натрия и 0,8 мл 0,05 М фосфатбуфера с рН 7,5 перемешивают между собой и доливают до 1,0 мл воды.

В пробе, взятой для сравнения, раствор формиата заменяется равным количеством воды, Для обеих проб при 366 нм измеряется начальная экстракция. После этого реакция продолжается за счет добавления 0,2 и ФДГ.

Спустя 30 мин определяется конец экстинции.

Результат вычисляют .с величиной для НАДН 3,4 cMl /ОМ по литературным данным. В 6-ти параллельно проводимых опытах получается значение при коэффициенте вариации 1„28%, Таким образом, результат статически не должен отличаться от теоретически определенной величины.

Определения в этих случаях проводят следующим образом.

Пример 2. Определение оксалата.

A. Оксалатадекарбоксилазу из

Co1lybia1utipes растворяют в 1 мл

0,2 моль/л и цитратного буферного ра створа с рН 4,0 К 0,07 мл этого раствора смешивают с 00,1 мл раствора пробы оксалата 0,5 ммоль/л и

30 мин выдерживают при комнатной температуре. Затем к пробе оксалата прибавляют 0,8 мл реактива из примера 1. После смешения замеряют экстинкцию при 366 нм и прибавляют формиатдегидрогеназу. После 30 мин вы. держивания при комнатной температуре снова измеряют экстйнкцию.

Результаты рассчитывают по лите.ратурным данным для НАДН Й

=.3,4 см /ммоль,99,4% взятой величины).

В трех параллельных опытах йолучают 0,0497 ммоль (99,4% взятой величины).

О, 01 мл 0 010 м/л водного НАД растнора, 0,02 мл 2,5 ммоль/л раствора натрийформиата и 0,1 мл

0ÄО5 моль/л фосфатного буферного раствора с рН 7,5 смешивают и доливают до 1,0 мл воды.

В сравнительной пробе раствор формиата заменяется одинаковым количеством воды. Для обеих проб измеряется затем начальная экстинкция при

39 366 нм. В результате добавки О 04 ед. е ° - Р

ФДК начинается рсакция. Через 50 мин считывается конечная экстинкция.

Результат рассчитывают с литературной величиной для НАДН

3 4 см / моль. При 6 параллельных J5 опытах получается 0,0502 мол =

=100Ä3% введенной величины прй вариационном коэффициенте 1,29%

Б. Верхний предел мг б

26

Иа НР04 12Н О 30, 59 3,059

ИаНЯ.РО4 НдО 2 02 0.202

НАД-L i 2ЙР 0 7, 05 О, 705

ФДГ 1,43 0,143

Н О Остальное Остальное

0,01 мл 0,01 моль/л водного НАДраствора, 0,02 мл 2,5 моль/л раствора натрийформиата и 0,8 мл

0,125 моль/л фосфатного буферного раствора с рН 7,5 смешинают и доли® вают до 1,0 мл воды.

В сравнительной пробе раствор формиата заменяется одинаковым количеством ноды. Для обеих проб измеряется затем начальная экстинкция при

Ç5 366 нм. Лотом начинается реакция в результате добавки 5,0 ед. ФДГ. Через 10 мин считывается конечная экстинкция.

Результат рассчитывают с литеращ турной величиной для НАДН

3,4 см /моль. При 6 параллельных опытах получается 0,0504 ммоль (100,7а введенной величины при вариациоином коэффициенте 1,28Ъ).

Иа НР04 12Н, О 6, 12 0,612

ИаН Р04 Н 0 0,40 О, 040

НАД-L i 2Н О 0,87 0,007

ФДГ 1,43 0,143 @ Н О 991,98 99,198

0,01 мл 0,01 моль/л водного НАДраствора, 0,02 мл 2,5 моль/л раствора натрийформиата и 0,4 мл

И 0.05 моль/л фосфатного буферного раствора смешивают и доливают до

0,2 мл воды.

В сравнительной пробе раствор формиата заменяется одинаковым количеством ноды. Для обеих проб измеряетИ ся затем начальная зкстинкция при

366 нм. В результате добавки 5,0 ед.

ФДГ начинается реакция. Через 10 мин считывается конечная экстинкция.

Результат рассчитынают с литера65 турной величиной для НАДН

860718

3,4 см /ф моль. При 6-ти параллель2 но проводимых опытах получается

0,0492 моль (98,3% введенной величины при вариационном коэффициен те 1,31%).

r. мг %

NayHPO< 12Н О 24,48 2,448

МИН РО4 Н О 1,611 0,161

НАД-Li 2HtO 7,05 0,705

ФДГ 0,056 0,006

Пример 3. Определение эфирамуравьиной кислоты.

1 ммоль эфирамуравьиной кислоты нагревают в водном растворе с

1,3 моль NaOH до тех пор, пока не перестанет изменяться величина рН °

Затем рН реакционного раствора устанавливают на 7,5 фосфорной кислотой, добавкой воды снижают концентрацию . образовавшегося формиата до

2,0 ммоль/л, а затем, как и в предыдущем примере, проводят определение добавкой реактива из примера 1.

Пример 4. ц.. Нижний предел

Формула изобретения!

0,153

0 153 мг

1,53

Формиатдегидрогеназа из Candida

boidinii

Никотинаденин динуклеотид лития

Динатрийфосфат

Мононатрийфосфат

Вода

О, 001-0,1

0,007-0,7

0,153-3,1

0,01-0,20

Остальное

0,10:О, 010

0,007

О, 001

Остальное,".0,1 мл 0,10 моль/л водного НАДраствора, 0,02 мл 2,5 моль/л раствора натрийформиата и 0,8 мл

0,10 моль/л фосфатного буферного раствора с рН 7,5 смешивают и доливают до 1,0 мл воды.

Составитель Л. Соломенцева

Техред Т,Маточка Корректор Н.Швыдкая

Редактор М.Митровка

Заказ 7598/32 Тираж 907 Подписное

ВНИИПИ Государотвенного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 йа НР04 - 12Н О (динатрийфосфат) 1,53

Na@H@PO4 Н О (мононатрийфосфат)

НАД-I. I i 2H O (никотинодениндинуклеотид) 0,07

Формиатдегидрогеназа (ФДГ) .0,01

Н.О Остальное

В сравнительной пробе раствор формиата заменяется одинаковым количест. вом воды. Для обеих проб измеряется затем начальная экстинкция при

366 нм. В результате добавки О,2 ед.

5 ФДГ начинается реакция Через 30 мин считывается конечная экстинкция.

Результат рассчитывают с литературной величиной для НАДН

3,4 см /ф моль. При 6 параллельных и опытах получается 0,0494 моль (98,7% введенной величины при вариационном коэффициенте,2,3%).

Реактив для определения формиата или соединений, переходящих в формиат, на водной основе, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью

20 повыаения эффективности реактива, он лополнительно содержит формиатдегидрогеназу э Candida boidini\ никотинадениндинуклеотид лития, дннатрийфосфат и мононатрийфосфат при

g5 следукщем соотношении компонентов, вес.%:

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Bergmeyer Н.U. Methoden der

enzymatisehen AnaIyse 3. An.f 1аде, Band I I, 1974., s 1591-1596.

2. Bergmeyer Н.U. Nethoden der

enzymatI schen Anal yse, 3. Anf 1 age, Вап4 I I, 1974, s 1591-1596 (прототип) .