Способ стабилизации глюкоамилазы

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Соеетскнк

Социалистических

Республик рв 872550

К АВТОРС34©МУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву— (22) Заявлено 100180 (21) 2868406/28-13 с присоединением заявки М— (23) ПриоритетОпубликовано 15.1081.Бюллетень Й938

Дата опубликования описания 1510.81 (5> W „з

С 12 M 9/96

Государственный комнтет

СССР но веерам нзобретеннй н втнрытнй (53) УДК 577.15 (O88.8) И.М. Грачева, В.В. Яровенко, P.Ë. Фил . пова . ": - ./ и М.Н. Силева !!. / с

Московский ордена Трудового Красного Энаьюни технологический институт пищевой промаиленности (72) Авторы изобретения (73) Заявитель (54) Изобретение относится к микробно логической промышленности, а также к крахмало-паточной, спиртовой, хлебопекарной, где ферментные препараты глюкоамилазы широко применяются.

Известен способ стабилизации e.t амилазы различными солями кальция, которые вводятся в препараты aL-амилазы во время или после очистки фермента 1т.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ стабилизации амилолитического фермента, заключающийся во введении в культуральную жидкость комплексного стабилизатора с последующей ее очисткой, где в качестве комплексного стабилизатора используют водорастворимую кальциевую соль и органический агент — алифатический гликоль, имеющий следующую формулу:

НО (СН Сн О)„Н или пропандиол, а в некоторых случаях неионогенное моющее средство f2) .

Недостатком известного способа стабилизации водных растворов фер HòÂ является невысокая остаточная активность фермента при длительном хранении (так через четыре недели в пробе остаточная активность составляет 51%), а таКже высокое процентное содержание органического стабилизатора (10%) в ферментном растворе.

Цель изобретения — удлинение сроков сохранения глюкоамилаэной активности при комнатной температуре и стерильности ферментного препарата.

Поставленная цель достигается тем, что в соответствии со способом стабилизации глюкоамилаэы, заключающимся во введении в культуральную жид35 кость комплексного стабилизатора с . последующей ее очисткой, в культуральную жидкость в качестве комплексного стабилизатора вводят формалин в количестве 0,1-0,3% совместно с

20 низином в количестве 1,4-1,6%.

П р и м е .р . Проводят стабилизацию глюкоамилаэной активности культуральной жидкости. Культуральную жидкость получают глубинным культи25 внрованием дрожжеподобного микроор.ганизма. Endomyco psis sp.20-9 на среде следующего состава, Ъ:

Кукурузный экстракт -3

Кукурузный крахмал 1

30, Олеи новая кислота 0,2

872550

Культуральную жидкость отделяют от биомассы на сепараторе AC1 -ÇÌ.

Полученный ферментный раствор отбирают в колбы с притертой пробкой (М 50 мл ) и туда же добавляют

1стабилизаторы различной концентрации.

В качестве стабилизаторов используют формалин, низин, а также комплексный стабилизатор — формалин + низин, Опыты проводят при комнатной температуре, Через определенные промежутки времени (О, 5, 14, 24, 32, 68 сут) в пробах определяют глюкоамилазную активность глюкооксидазным методом, содержание белковых веществметодом Лоури, а также наличие бактериального заражения.

Полученные данные приведены в табл. 1.

Наибольшим стабилизирующим эффектом обладает комплексный стабилиза- ур тор, состоящий из формалина (0,2Ъ) и низина (1,5Ъ), обнаруживающий синергическое действие. На 32-ые сутки хранения потери глюкоамилаэной активности составляет всего 8Ъ по сравнению с контролем. В контроле за это же время хранения глюкоамилазная активность снижается на 56Ъ (с

13,3 ед/мл до 5,8 ед/мл). Изменение концентрации комплексного стабилизатора от 0,2Ъ до 1,5Ъ на 32-ые сутки () хранения сопровождается сохранением ферментативной активности в образцах (7, 8, 9) на уровне 9,4-12,3ед/мл.

|Дальнейшее увеличение дозировки стабилизатора до 2,0Ъ (проба 10) приво- 35 дит к уменьшению глюкоамилазной активности, которая составляет 9,0 ед/мл.

При обработке культуральной жидкости формалином увеличение его дозировки от 0,2Ъ до 1,5Ъ сопровожда- 4О ется на 32-ые сутки хранения уменьшением глюкоамилазной активности .в образцах (1, 2, 3) с 9,37 ед/мл до

6,25 ед/мл, в то время как содержание белка находится на уровне 4,95,95 мг/мп.

Следовательно, оптимальное количество формалина в растворе — 0,2Ъ, при этом активность фермента уменьшается по сравнению с контролем (13, 3 ед/мл) на 30Ъ.

Наименьший стабилизирующий эффект проявляется при добавлении в культуральную жидкость одного низина, в этом случае падение активности на

32-ые сутки хранения составляет

48-60Ъ.

Удельная активность при обработке комплексным стабилизатором меньше по сравнению с активностью при обработке формалином в связи с более высоким содержанием белка, что можно объяснить белковой природой низина, представляющего собой полипептид.

На 32-ые сутки хранения в образцах с формалином (1, 2, 3) и комплексным стабилизатором (7, 8, 9,10) бактериальное заражение не обнаруживается, тогда как в контроле и в образцах с одним низином (4, 5, 6) бактериальное заражение отмечается уже на 5-ые сутки хранения. На 52-ые сутки стабилизации культуральной жидкости все образцы подвергают бактериальному заражению за исключением пробы Р 3, содержащей 1,5Ъ формалина, однако в этой пробе на 32-ые сутки хранения сохраняется только 47Ъ глюкоамилазной активности.

В табл. 2 приведены данные, характеризующие остаточную глюкоамилазную активность, выраженную в процентах к исходной пробе. Образцы, приведенные в этой таблице, содержат оптимальное количество стабилизатора.

Результаты свидетельствуют, что при добавлении в культуральную жидкость Endomycopsis sp. 20-9 комплексного стабилизатора, состоящего из формалина в количестве 0,2;5и низина в количестве 1,5Ъ, удается в течение

32 сут сохранить на 92Ъ глюкоамилазную активность и предотвратить бак— териальное заражение.

Реализация изобретения позволяет удлинить сроки сохранения глюкоамилазной активности при комнатной температуре и стерильности ферментного препарата.

872550

СЧ

СЧ с

Ч

tQ

9

«

I с-{ с с

00 с с { an

%{ %Ч

ЧР

СО Щ

В»

О О{

1 %

Ю о с

О1

an

СЧ О1 с .. с

СО О1

%-{ м л ь

% { с Ч:)

Ч) \О Ю с

СЧ О1 т» а-{

СЧ с

{б х

1 A «at A 4 х «. Е

9« ох цхос

1>e<9

{Ч an.О СО с с

СЧ с-{

aD со Ф сч о ю м с с

%-{ %.» %-{ %-{

{ х

9 Х о е

Я {б

Д

1, х м

Ю с

%-М {

СО с о

1 с

I O5

Ц

1 9 4

1 «С«Е

I

C{l СЧ с

CO с-{{ " М

СО с

СЧ -{ о

«

1 1 9

I oe

1 Х {

I Я ф

1 Гч сб

1

an ! ! ! 1-{

1

«

« с

«»

x o

eo)

Ре х ц х «9

СО

Ю с

%-{ н

° Ф с.

Ю

%-1

СО с.

Ю

% 1 м с

{ {

СО Ф с ° н н -{ Т-{ { o с.

СЧ М

Сс с о

%-М

Ю Ф СЧ

«» { w 0««o с. с с

{ Ч { О СЧ с

aat 4 н Е

U c. о ct х 9

СО с

М>

an

1 с

I

an с

% { е

{О с

%-{ м сС{ an с с

О1 -, %-{

Ю с м т-{

{Г)

«с

I м

1 с

I

1«! с м с м

Ч {

{ с с

СЧ

%-{ м с м

%-{ м с м -{ м с м ч-{ с"1 м м с м м м

%{%{%{ м с

% {

О1 с

Т-{

e a{t g

ta: «{t O

9ХОУ о

1 {бХ 1 !

» 1 . > {б е

Ц U (б m Oa ое«ro

;б Z O { «

1

СЧ ! ! о

t. (о an с

%-Ф %-{

СЧ с

Ю о с

%-{

СЧ О сС{ О с с °

Ю «-» т-{ СЧ

1

I х

1 3

13

СЧ

1 с с

1 aat

0

I б«О4

I ххах ! Ф {{t

{«14хЦ

I 9!»9 и

«б 1

Я С41 Х С

«{С« — -t

И с{ с

« I

«:Х! I mXO

Ха«О99О

Я Й 1 Х Ц Х

{б 1 $ g tk Р3 сМ и t4{e t»

Я I

m {б

{б «х«

{ 1 aat «tt

1 Ц Х

e t{ 1 ц х ох« б хх«.

Я 9

{:Х I.

4 е 1 ICI О9

ä gI { с.

>t» 94

e>IIIIX

m o

Х I

«» Ю ! {б

{ОХ! Осб е C4 I и

I V. I Ry

Г @

Ю аС« {С{ СЧ !сс СЧ Ch М С« С-{

Ю { Г {Ч О а an М W Co л с л с с с с сч { { { { о { { { о

{С«.сГ Ю {Ч {с М C{a an с с . a с с с

О {с«ч> a{! Со р {О

an СЧ an {с т-{ сй о ю со со м с с. ° с. с. с.. ю

СЧ СЧ т-{ с» т-{ с-»

872550

Г р М <с(Ch Ch Г с

Ю Ю

Ю с

%-(с ° с с с с э о ю

С3 а-(Ф ОЪ (с3 Ln

° (с с с .. с с

Ln ч39 . Ln aCL Л Ch Ю н м с

%(3 O с с

° ln 3 (О

Г3 Л М Л с с с

Ch Ch Л С3

Ch ОО Л о л гч

1 с

aA3

%-(г

О со Ln с сг сО

Ln (м сО сО г с с. с ю о о н (л (Ъ ч3(с

% 1 (%(Л О т3 Ф м с-(( с с с

%(% % (сО О с с о.

Ln N с с (О СО

Ln л

О,5 с Ф, Ln LA л

М СО Л с с

\О Л ОЪ

СО М с с

Ю

%1 %1 с-(л

° Ф Сс( с с с

ОЪ Г (О

%Ч Ф м с с

LA 1О л с1 1О г Ъ с с с

Ch О (3 " (Ю о со с с

Ch Л с (г ъ

Ch . сР с с

%-4 %-3

ОЪ

l о

lA Ф сО 3 с о о сО (3 СЧ с с

%-(м-4

Г О ОЪ

° -(00 Ch с с о о

Л О\ с с чР г л с

Ch (в о с с с

lA LA Ч) Ф 3 с с О (CL м

Ю с л

М Ch

° а 3 с( с с с

Ch O Cl3

%(ч(м сР

М СО с с

ОЪ Л о л с с

%-(%-(о

°, (с(с с

О г ч-3

+ с ь

L ж Ф ъЧ

О\ Г с с с с

Оъ Л Л Л О о л

L с о (((-

lA О с о н т"(3 о а

3» о

872550

Таблица 2

Стабилиз атор

Количест Остаточн ая глюкоамилаз н ая активность, % к исходной, при длительности хранения, сут во стаби14

68

24 лизатора, Ъ

0,2 100. 94 81 73 70 69

1,5 100 89 68 53 52 36

0,2

1,5 100 98 95 93 92 72

100 78 54 44 44 . 34.Контроль

Формула изобретения

Способ стабилизации глюкоамилазы, заключающийся во введении в кулътуральную жидкость комплексного стабилизатора с последующей ее очисткой, отлич ающийоятем, что, с целью удлинения сроков сохранения глюкоамилазной активности при комнатной температуре и стерильности ферментного препарата, в культуральСоставитель Е. Воробьева

Редактор С. Тимохина Техред Ж.Кастелевич Корректор С. Щомак

3 аказ 8950/41 Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формалин

Низин

Формалин+

Низин ную жидкость в качестве комплексного стабилизатора вводят формалин в количестве 0,1-0,3% совместно с низином в количестве 1,4-1,6%.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 9 3524798, кл. С 12 0 опублик. 1971.

2. Патент CIUA 9 3819528, кл. С 12 0 опублик. 1976 (прототип).