Способ получения антибиотического комплекса,включающего непланоцины а,в,с,д и f

 

ОП ИКАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К AATKHT3

Союа Советских

Социалистических

Республик (ii)906388 (61)Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 17.05. 79 (21) 2763801/28-13 (51) М. Кл.

3 (23} Приоритет — (32) 25.05 ° 78 10.08. 78

29,01.79 23.02.79 (31) >3 62899 э 53 9802 (83) Япония,i 54-8205, 54-21 201

Опубликовано 15 02.82.Бюллетень № 6

С 12 Р 1/06

Веударотееииый иоиитет

СССР ао делзи изобретений и открытий (53) УДК 615.779..9(088 ° 8) !

Дата опубликования описания 15.02.82

Иностранцы

Масару Отани, Сатоси Ягинума, Масатоси Цудзнно, Наоки Муто, Тецу Саито, Тадасиро Фудзии (Япония) (723 вторы изобретения

Иностранная фирма

ll ю/

Тойо Дзозо Кабусики !Кайся (Япония) (71) Заявитель!

Р

I! с (54) СПОСОБ .ПОЛУЧЕНИЯ АНТИВИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА, ВКИОЧАНМЦЕГО НЕШ1АНОЦИН111

А, В, С, D H F

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотиков.

Препложенный антибиотический комплекс новый и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение антибиотического комплекса, нон,с! включающего непланоцины А, В. С 0 и F ° 1О

Эта цель достигается тем, что Y получение антибиотического комплекса, включающего непланоцины А, В, С, О и F общей формулы готЕ Х вЂ” NH unu ОН

2 — HO-Нр б или

ОХ еое Г- — Π— unu

Epneum o р сЯя,ув, осуществляют путем культивирова.ния штамма Ampullàг!еllа А 11079

1а FERN-P Ф 4494 в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганическое вещество, выделяют целевой продукт из культуральной жидкости и(илн) разделяют его на

20 непланоцины А, В, С, 0 и F.

Итамм, продуцирующий непланоцнны, выделен из образцов почвы, взятой с поля в Ниагатакен (Япония), которое засеяно луком, относится к роду

25 Ampullariella виду Ampullагiella

906388

3

А 11079 и находится на хранении в постоянной коллекции в институте микробиологической промышленности и технологии в Японии, под номером

FERN-P 1Ф 4494.

Иорфологические признаки.

На среде неорганическая соль с крахмальным агаром при 30 С образует искривленный и разветвленный субстратный мицелий диаметром 0 5- 10

0,8 мкм и не совсем созревший воздушный мицелий.

Форма спорангий цилиндрическая или бутылочная, размер 5-15> 1025 мкм. t5

Спорангиоспоры находятся в параллельных цепях со спорангием. Спо" рангиоспоры имеют полярно расположенные жгутики и имеют форму палочек размером 0,5-1,0 > 1,0-2,0 мкм. gg

Купьтуральные признаки.

Среда Воксмана Р 1. Рост слабый, спорангий не образует, субстратный мицелий бесцветный или бамбуковый, растворимый пигмент отсутствует. . Питательный агар. Рост слабый, спорангия нет, субстратный мицелий от светло-янтарного до светло-коричневого, растворимый пигмент 30 лотисто-коричневый. ЗО

Агар Эмерсона. Рост хороший снорангий отсутствует, субстратны мицелий светло-коричневый-камелевый, растворимый пигмент бледно-золотисто-коричневый.

Агар Беннета. Рост хороший, спорангий отсутствует, субстратный мицелий янтарный, растворимый пигмент бледнозолотисто-коричневый.

Дрожжевой агар Чапека. Рост хороший, спорангий мало, субстратный мицелий янтарный, растворимый пигмент отсутствует.

Казеионовый агар. Рост хороший, спорангий отсутствует, субстратный мицелий от камелевого до светло-коничневого цвета, растворимый пигмент гвоздично-коричневый.

Сахарозо-нитратный агар. Рост слабый, спорангий небольшой, субстратN ный мицелий нерламутрово-розовый, светло-желтый, растворимого пигмента нет.

Глюкозо-аспарагиновый агар. Рост средний, спорангий небольшой. Субстратный мицелий бамбуковый, перламутрово-розовый, растворимого пигмента нет.

Глицерин-аспарагиновый агар. Рост слабый, спорангия нет, субстратный мицелий бамбуковый, перламутрово-розовьп, растворимого пигмента нет.

Тирозиновый агар. Рост слабый, спорангия нет, субстратный мицелий светло-янтарный, растворимый пигмент отсутствует.

Агар с овсяной мукой. Рост хороший, спорангии средний, субстратный мицелий янтарный, ярко-маисовый, растворимый пигмент отсутствует.

Дрожжевой-солодовый агар. Рост хороший, спорангий плохой, субстратный мицелий цвета топаза, растворимый пигмент бледный.

Глюкоэо-дрохжевой агар. Рост хороший, спорангий отсутствует, субстратный мицелий светло-коричневый, растворимый пигмент золотисто-коричневый.

Глицерин-нитратный агар. Рост средний, спорангия нет, субстратный мицелий бесцветный-бамбуковый, растворимый пигмент отсутствует.

Физиологические свойства.

Хорошо усваивает L-арабиноэу, D-кислозу, D-глюкозу, D-фруктоэу, D-маннозу, MammA L.-рамнозу, сахарозу, крахмал, салицин, галактозу, глицерин, трегалозу, мальтозу, целлобиозу.

Не усваивает инозит, Р-лактозу, рафинозу, целлюлозу, L-сорбоэу, 1.-мелибиозу, 0-рибозу,мелезитоэу, D-сорбит, дульцит.

Оптимальная температура роста

10-45 С. Снятое молоко пептониэирует и коагулирует.

Крахмал гидролизует.

Гидролиз целлюлозы отрицательный.

Казеин гидролизует.

Желатин не разжижает.

Тирозин не разлагает.

Образует меланин на пептонной црожжевой и железосодержащей агаро вой среде, на тирозиновой агаровой среде меланин не Образуется.

Ксантин, гипоксантин не разлагает.

Сероводород не выпеляет.

Нитраты ие восстанавливает.

Антибиотический комплекс включает непланоцииы А, В, С, D u F.

Непланоцин А представляет собой слабое основание и имеет следующие

Физико-химические характеристики.

906388

Элементарный анализ.

Найдено, %: углерода 49,96%, водорода 5,00%, азота 26,43Х.

Вычислено, %: углерода 50,19Х водорода 4,97Х, азота 26,60%.

Молекулярный вес 263.

Молекулярная формула C

Точка плавления 216 С.

2о

Удельное вращение. (

УФ спектр поглощения 14у /мл) ,1 /о в Н20 g о =2630 1, Е1с,о =602,1; при рН 10Р, 2630 А, Е„ „ =595,0, Инфракрасный спектр поглощения (KBr)

Полосы поглощения при 3360, 2920, 1640, 1600, 1570, 1480, 1415, 1370, 1330, 1300, 1250, 1205, 1160, 1115, 1080, 1050, 1005, 910, 850, 790, 730 см (Растворимость.

Растворим в воде, диметилсульфоксиде, диметнлформамиде, уксусной кислоте и водном ацетоне.

Нерастворим в этилацетате, хлороформе, бензоле и гексане.

Цветные реакции.

Положительная: обесцвечивание перманганата калия, периодатное окисле- 50 ние и анисовый альдегид, Отрицательная: хлорид железа, нингидрин, анилинфталат, Молиша и Фелинга.

Слабое основание. 35

Белые игольчатые кристаллы.

Величина Rf, н-бутанол: уксусная кислота: вода

6:1:1, Rf 0,36; и-бутанол: концентрированный нашатырный спирт: вода- 40

-10:0,5:2, Rf=-0,27; Н-пропанол: концентрированный нашатырный спирт: вода-10:1:1, И=0,41 ацетон: вода

=10:1, Rf=0,34; этилацетат: метанол: вода=10:2:1 Rf=0,21; хлороформ: <5 метанол: уксусная кислота — 10:2:1, КФ =О, 17.

Химическая структура

55

НΠ— Н

ОН ОХ

Биологические свойства непланоцина А следующие.

Активность, подавляющая рост патогенных грибов растений : 100 )"/мл раствор непланоцина А в чашке с агаровой средой Helminthosporium oryzae

М0306 характеризуется зоной подавления диаметром IS,9 мм.

Противоопухолевая активность.

Мьслам внутрибрюшинно вводили 10 опухолевых клеток лейкемии d.=1210 и спустя день в течение пяти дней внутрибрюшинно адин раз в день вводили непланоцин А дозировки 0,16 мг/кг

0,32 мг/кг, 0,63 мг/кг, 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг и 0,5 мг/кг, соответственно) . Для эксперимента брали контрольную группу из 10 мышей и по семь мышей в каждой подопытной группе. При

15-дневном наблюдении средняя продолжительность жизни для контрольной группы составила 7,4 дня. Увеличение продолжительности 1мзни для подвергнутых лекарственнои обработке животных по сравнению с контрольными животными равно 158% при дозировке

0,16 мг/кг, 170% при 0,32 мг/кг, в случае введения 2,5 и 5 мг/кг не отмечалось никакой смертности.

Аналогичный эффект значительного продления гияни при лечении непланоцином А наблюдается и в случае асцита опухоли Эрлича, Саркомы 180, лейкемии Р-388, поражающей мышей и крыс, Саркомы Еошиды.

Острая токсичность.

LD : 13 7 мг/кг (внутрибрюшинно, Я) на мышах) ., Внутрибрюшинное введение в течение 14 дней раз в день дозы 5 мг/кг не вызывало никакой смертности, Для лечения острой лейкемии лекарство следует вводить внутривенно в дозированных формах 5-20 мг/день, растворенное в физиологическом растворе, один раз в день в течение семи дней. Непланоцин А также эффективен для лечения хронической лейкемии, злокачественной опухоли желудочно-киыечного тракта, легочной карциномы, рака матки, рака молочной железы и злокачественной лимфатической лейкемии.

Непланоцин А может применяться в виде физиологически приемлемых солей минеральных кислот или органических кислот, а именно хлоргидрата, 906388

Структурная формула щн, 10 ()11 ОН

50 ацетата, тертрата, цитрата или сукцината.

Непланоцин С представляет собой слабое основание и имеет следующие характеристики.

Элементарный анализ.

Найдено : углерода 47,59Х, ьодорода 4,64Х, азота 25,10Х.

Вычислено: углерода 47,3IX, водорода 4,66Х., азота 25,05Х.

Молекулярный вес 279

Молекулярная форма С Н 11 0

1 13 5 4

Точка плавления 226 С (с разложением).

Удельное вращение.4о() =-43,6 (с=0,67%, Н О).

УФ спектр поглощения (16 Я /мл) в Н20 У вп3<-2630 Ар Е1см ., 538,9. при рН 3:3.„33ду=2590 А, Е см =510,8, при рН 10:А„3оу2630 1, К„" =534,4.

Инфракрасный спектр поглощения (KBr).

Полосы поглощения при 3450-3100, 2920, 2740, 2680, 1680, 1630, 1600, 1560, 1500, 1460, 1420, 1380, 1360, 1330, 1300, !240, 1200, 1170, 1100, 1050, 1020, 960, 920, 900, 880, 830, 780, 680 см,.

Спектр ядерного магнитного резонанса (внутренний стандарт 0, в дейтеририйдиметилсульфоксиде, 100 МГц).

Раств ории в воде, диметилсульфоксиде, диметилформамиде.

Нерастворим в этилпетате, хлоро35 форме, бензоле и гексене.

Цветная реакция.

Положительная: обесцвечивание перманганата калия, периодата и Талленса.

Отрицательная: хлорид железа, нингидрин, анисовый альдегид и Noлиша.

Слабое основание.

Бесцветные пластинчатые кристаллы. Rf величина.

И -бутанол:. Уксусная кислота: вода-6:1:1, Rf=0 33 и -бутанол: концентрированный, нашатырный спирт: водаещ10:0,5:2, Rf=0,19; И -пропанол: концентрированный нашатырный спирт: вода 10:1:l, 1 =0,30, ацетон: вода10: 1, Rf=0,43, этилацетат: метанол: вода=10:2:1, Rf=0,27, хлороформ: метанол: уксусная кислота 10:

2: 1, Rf=0, 20.

Непланоцин С обладает следующими биологическими свойствами, Подавляющая активность роста патогенных грибов растении: 100 Не!п11nthospor|um oryzae M 0306:31,4 мм (зона подавления) С1adosporium herbarum М 4278:14,0 мм (зона подавления) Alternaria kikuchiana М 4588:

12,0 мм (зона подавления)

Острая токсичность.

1 О 55 мг/кг (внутрибрюшинно мышам}.

Непланоцин С может использоваться в виде физиологически приемлемой соли минеральной кислоты или органической кислоты, такой как хлоргидрат, ацетат, тертрат., цитрат или сукцинат.

Противоопухолевая активность.

Непланоцин С полностью подавляет рост лейкемических клеток L-5178У в концентрации 0,8 /мл in vitro.

При внутрибрюшинном введении в дозах 10 мг/кг непланоцин С оказывает пролонгирующий эффект в отношении продолжительности жизни при заражении лейкемией L-1210, составляющий 131Х от контрольной группы.

Непланоцин 0 имеет следующие физико-химические характеристики.

Элементарный анализ, С 49,70%, Н 4,64%, и 21,20Х, Молекулярный вес 264, Молекулярная формула,1Н, 1,10А,.

Точка плавления 236-237 С.

Удельное вращение:(оД, =-145

2Ъ (с=0,6Х, Н О).

УФ спектр поглощения „, в воде) „У к=2510 А, Е,(сн =479 ; в кислой воде: З Ук1 =2510 А, в щелочной воде1. =2560 А, 1% г

В ам

Инфракрасный спектр поглощения (кВг) .

Полосы поглощения при 3420-3120, 2940 2880р 1680э 1580э 1545э 1510э

1О

906388

OK 0H

КОН 1!

ОН.

1440, 390, 1305 1210, 1110, 1075, 1040» 1000» 990» 975» 900» 845»

780 см

Спектр К1Р (внутренний стандарт

Оц, в дейтерийдиметилсульфоксиде, 1ОО ИГц) .

Растворим в воде, диметилсульфоксиде, диметилформамиде, уксусной кислоте и пиридине.

Нерастворим в этиловом эфире уксусной кислоты, хлороформе, бенэоле и гексане, Цветная реакция.

Положительная: обесцвечивает перманганат калия и окисляет перйодат.

Отрицательная: нингидрин, Фелинга и хлорид железа.

Белые игольчатые кристаллы. . Rf величина.

И-бутанол: уксусная кислота: вода-6:1:1, Rf=0,27, Н-бутанол: концентрированный нашатырный спирт: вода-10:0,5:2, Rf»0,07; И вЂ” пропанол: концентрированный спирт: вода-10;

:1:! Rf»0,18, ацетон: вода-10:1, Rf=0,33.

Структурная формула

Острая токсичность непланоцина О.

При интраперитониальном введении мьппам непланоцина Д в количестве

100 мг/кг не отмечается никакого смертельного исхода.

Непланоцин В имеет следующие физико-химические характеристики.

Элементарный анализ. С 47,44%, Н 4,63%, Й 25»07%.

Молекулярный вес 279. молекулярная формула См НрМГ04

Точка плавления 269-272 С (с разложением) .

24

Удельное вращение.!с!.! =-3,5 (C»I,О%, диметилсульфоксид).

УФ спектр поглощения в воде: 3, „ »2620 А, Е, »530,4; в кислой воде {одна капля Хи с <»

»2590 А, К<се»506,7 0,1 í. HCI); в щелочной воде (одна капля Л„ „

»2630 А, Е„,." =522,2 0»I н. NaOH)

Инфракрасный спектр поглощения (KBr) .

s Полосы гоглощения при 3380, 3280, 3100, 2920, 2880, 2740, 1700, 1610, 1570, 1520, 1480, 1420, 1380, 1350, 1300, 1250, 1220, 1170, 1160, 1100, 1080, 1030, 1020, 980, 970, 870, 840» 790, 730, 710 см

Спектр ЯИР (внутренний стандарт

0, в дейтерийдиметилсульфоксиде, 100 МГц) .

Растворим в воде, диметилсуфок- сиде.

Нерастворим в этилацетате, хлороформе, бензоле и серном эфире.

Цветная реакция.

Слегка положительная: обеспечива20 ет перманганат калия.

Отрицательная: нингидрин, Иолиша и анисовый альдегид.

Слабое основание.

Белие пластннчатые кристаллы.

Rf величина.

Н -бутанол: уксусная кислота: вода-6:I:1, Rf=0,42, H --бутанол: концентрированный нашатырный спирт: вода-10:0,5:2, Rf»0»27, Н -пропанол:

З0 концентрированный нашатырный спирт: вода-10:1:1, Rf=0,41; ацетон: вода10:1:1, Rf=0,48.

Структурная формула

Непланоцин F обладает следующими физико-химическими свойствами.

Элементарный анализ. С 48,74%, Н 4,83%, N 25,71 ., (содержит кристаллизационную воду) .

11олекулярный вес 263 Н

Молекулярная формула С,„Н„й Оз-Н„О.

Точка плавления 223 С <с разложением).

З

Удельное вращение. fd 3 =-6,6 (с»0,8 Н О) .

УФ спектр поглощения „. в воде: Лpax»2630 А, Е ск»548» 7, 25

НО-Нгб

ОН.

Непланоцин B u F имеют следующие биологические свойства.

Острая токсичность.

Интрапарентеральное введение мышам непланоцина В или F в количестве 100 мг/кг не вызывало смертельного исхода.

Подавление роста клеток, Непланоцин В в количестве 0,8" "/мл и непланоцин F в количестве 20 Д /мл подавляют рост клеток лимфомы

< - -5178 у

При внутрибрюшинном введении непланоцина В в количестве 50 мг/кг препарат оказывает пролонгирующее

11 9063 в кислой воде (одна капля О, 1

=2600 А> j - <сн =527,1, н. НС 1); в щелочной воде (одна капля О, 1 „„, .1 /ь еах

=2630 А, Е =531,8 н.Na0H), Инфракрасньш спектр поглощения (кВг) .

Полосы поглощения при 3320, 3210, 2920, 1650, 16 10, 1580, 1480, 1420, 1380, 1340, 1310, 1270, 1220, 1180, 1110, 1070, !020, 980, 900, 840, 800, 730 см".

Спектр ЯМР (внутренний стандарт

О,:., в дейтерийдиметилсульфоксиде, j00 М1ц).

j5

Растворимость.

Растворим в воде, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте.

Нерастворим в этилацетате, хлороформе, бензоле и серном эфире.

Цветная реакция.

Положительная: обесцвечивает перманганат калия.

Отрицательная: хлорид железа, нингидрин и Фелинга.

- Природа. Слабое основание.

Белые игольчатые кристаллы.

Rf Величина.

Н-бутанол: уксусная кислота: вода

6;1:!, Rf=0,51 ; Н -бутанол: концентри- з0 рованный нашатырный спирт: вода-1О:

0,5:2, Rf=0,43, Н -пропанол: концентрированный спирт: вода-10:1:1, Rf=0,59; ацетон: вода-10:1, Rf=0,48.

Структурная формула

ЮН7

88 12 действие на срок жизни — 142% от контрольной группы.

Непланоцин оказывает антидепрессивное действие.

Антибиотический комплекс, включающий непланоцины А., В, С, 0 и F получают, например, путем инокулирования штамма вида Ampuj1агiеlla

А 11079 ГЕКИ-Р 11 - 4494 в подходящей питательной среде. Микроорганизмы могут выращиваться различными способами в искусственной среде или естественной среде, жидкой или твердой культуре. При промышленном получении предпочтительна жидкая среда.

Для составления среды могут применяться усваиваемые источники углерода, источники азота, неорганические соли и другие вещества, и эта среда применяется для микроорганизмов, производящих антибиотики непланоцины, В качестве источника углерода можно применять глюкозу, сахарозу, глицерин, растворимый крахмал и тому подобные материалы. В качестве источника усваиваемого азота могут применяться пептон, порошок соевых бобов, экстракт пшеницы, мясной экстракт, рисовые отруби, гидролизат казеина натрат, аммониевая соль и т.п. Могут также применяться такие неорганические соли, как хлористый натрий, фосфат (кальция, магния, железа или марганца). Может добавляться противопенное вещество, такое как силиконовое масло или соевое масло.

В случае жидкой культуры предпочтительно применяется погруженная аэрируемая культура. В этом случае выращивание осуществляют при оптимальной для микроорганизмов температуре, предпочтительно 25-30ОС.

Продолжительность выращивания зави— сит от применяемых условий и обычно равна 2-4 дням. рН среды при выращивании регулируется от нейтральной до слегка кислой.

Такая среда содержит антибиотики-непланоцины. Выделение антибиотиков-непланоцинов осуществляют стандартным выделением.или отделением— способами, применяемыми для выделения продуктов обмена микроорганизмов. Так как непланоцины представляют собой слабые основания они могут быть выделены путем поглощения приемлемыми адсорбентами с после906388

Непланоцин А также может быть получен из непланоцина 0 через производные непланоцииа 0.

Для этого три гидроксильные группы в циклопентеновом кольце непланоцина 0 взаимодействуют с бензоил" хлоридом. Гидроксильную группу в адениновой структуре непланоцина

D заменяют маркапто-группой, для чего осуществляют реакцию например, 50 дующим элюированием подходящим растворителем. В качестве адсорбентов могут применяться активный углерод, катионо-обменные смолы, активированный глинозем или силикагель. Элвирувщие растворители выбирают в зависимости от применяемого адсорбента, например это могут быть смешивающиеся с водой органические растворители, такие как водный метанол, 10 водный ацетон или водный диоксан, или растворы солей, или кислые щелочные растворы, Кроме того, непланоцины могут выделяться и очищаться как вещества слабощелочной природы. На- 15 пример, антибиотики поглощавт катионо-обменной .смолой, такой как Амберлит 1RP-50 или Доувек 50 и элюирувт приемлемым кислым, щелочным или солевым раствором, 20

Для выделения, элюирования и очистки антибиотиков предпочтительно может применяться сочетание адсорбента и ионо-обменной смолы. Например, фильтрат культуры загружают в 25 катионо-обменную смолу Амберлит

1R-120 для поглощения антибиотика, элюируют щелочным раствором, рН 3,7 нормальным водным раствором аммиака, с получением активной фракции, и пос- ЗО ле регулирования рН до нейтральной или слабо щелочной среды антибиотики адсорбируют активированным углем с последующим эл оированием 70%-ным метанолом. Элюат адсорбируют анионо-обменной смолой Амберлит lRA-410 и вновь элвирувт водой для сбора активных фракций. Объединенные фракции концентрируют, получая сырой продукт, который затем подвергают очист- 40 ке на силикагеле. Дальнейшую очистку осуществляют перекристаллизацией.

Чистота может быть определена по единственной точке плавления или единственному пятну на бумажной хроматографии, тонкослойной хроматографии и бумажном электрофорезе при 2630 А

Уф-света, с пятисернистым фосфором, затем удаляют защитную группу для гидроксильнсй группы, в результате получают производное непланоцина D. Метили" рованием его метилйодидом получают производное непланоцина О. Производное непланоцина 0 обрабатывают метанольным аммиаком, в результате получают непланоцин А.

Кроме того, три гидроксильные группы в циклопентеновом кольце непланоцина 0 получают путем ацелирования. Это достигается путем взаимодействия с уксусным ангидридом.

Затем указанное соединение превращают в производное непланоцина О путем взаимодействия с хлористым тионилом. Производное непланоцина D может превращаться в непланоцин А через производное непланоцина 0 путем обработки метанольным раствором аммиака.

II р и м е р 1. В колбу емкостью

500 мл загружают 100 мл водной среды (pH 6,5), содержащей 2% глюкозы, 2% крахмала, 1Х дрожжевого экстракта, 1% гидролизата казеина и

0,2% карбоната кальция. Содержимое о колбы стерилизуют 15 мин при 120 С.

Ь две колбы этой среды высевают одну петлю со скошенной культурой вида Ampullariel1а А 11079 FERtl-P

¹ 4494 и встряхивают при 30 С. Чере3 четыре дня культуральну:> среду переносят в 20 л такой же стерилизованной среды, которая находится в бродильном чане, емкостью 30 л и вырашивают при 30 С при перемешивании с 300 об/мин и аэрировании

20 л/мин в течение 48 ч.

Выращенную таким путем среду переводят в 200 л водной среды(рН 6,5) содержащей 4% глюкозы, 1% порошка соевых бобов, 0,4% мясного экстракта, 0,4Х пептона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,25% хлористого натрия и 0,1Х карбпната кальция и выращивают при 30 С при перемешивании с о, 180 об/мин и аэрирование 130 л/мин в течение 40 ч. Полученный бульон (примерно 200 л) фильтруют, и гриб- ницу промыва от водой. Фильтрат и промывочную воду объединяют, в результате чего получают примерно

140 л прозрачного фильтрата (активность 57 мкг/мл как непланоцин А).

Пример 2. Полученный в примере 1 фильтрат пропускают через ко15 906 лонку с 20 л катионо-обменной смолы Амберлит IR-120 (Н тип), где происходит адсорбция материала, затем колонку промывают 100 л воды.

Элюирование производят нормальным водным раствором аммиака, рН 3,7 °

Начальный элюат (30 л) сбрасывают, 90 л последующего .:.элюата собирают, доводят рН его до 8 добавлением

6 н. соляной кислоты, затем пропускают через 4 л активированного угля в колонке, промывают водой, элюируют 90 л 70 -ным метанольным раствором. Полученный элюат концентрируют при пониженном давлении, получая

1,5 л концентрата. Концентрат вводят в колонку, заполненнув 10 л катионообменной смолы Амберлит 1РА-410 (ОН типа) и элюируют водой. Добавлением 4 н. соляной кислоты регулируют рН до 7. Элват концентрирувт в вакууме, осаждают материал при охлаждении и фильтруют, получая 41 8 г сырого непланоцина А (чистоты примерно 12 ).

Неочищенный непланоцин А (41,8 г) растворяют в малом количестве воды и вводят в колонку (8,3 40 cM), заполненную 2 л силикагеля со смесью растворителей — н-бутанол: 28/-ный водный аммиак: вода=10:0,2:I и затем элюирувт той же смесью растворителей ° Отделяют каждые 150 мл фракции, актиьные фракции соответствуют фракциям РР 24-52. Их собирают, концентрируют в вакууме и выдерживавт при охлаждении. Осадок отфильтровывают, получая 2,6 г сырого кристаллического непланоцина А (выход 32 ).

Сырой непланоцин А растворявт примерно в 60 мл горячей воды и выдерживают при комнатной температуре.

Выделившиеся в осадок белые игольчатые кристаллы отфильтровывают, получая 2,0! r кристаллов непланоцина А (выход 25,2 ).

Пример 3. Фильтрат (140 л, активностью 300 мкг/мл как непланоцин

С), приготовленный в соответствии с той же методикой что и в примере пропускают через колонку с 20 л катионо-обменной смолы Амберлит

IR-120 (Н типа) для адсорбции мате,!. риала и затем промывают примерно

100 л воды. Элюирование осуществляют нормальный водным раствором аммиака рН 3» начальный элюат (20 л) сливают. Затеи собирают 100 л по388

l6 следующего элюата, регулируют рН до

8 путем добавления концентрированной соляной кислоты, пропускают через колонку с 4 л активированного угля, промывают водой, элюируют 70 л

70%-ным раствором метилового спирта.

Полученный элюат концентрируют при пониженном давлении, получая 1,5 л концентрата. Концентрат сушат при

1о температуре ниже О С, в результате получают 83,6 r сырого порошка (чистотой 29,5/).

83 г сырого порошка .растворяют в водном насыщенном растворе Й-бу13 тилового спирта и вводят в колонку

8,3 40 см, загруженную 2 л силикагеля с н-бутиловым спиртом, а затем элюирувт смесью растворителей— н-бутанол: концентрированный> вод2п ный аммиак: вода-10:0,2:1. Отделяют каждую фракцию объемом 150 мл, Активные фракции соответствуют фракциям РР 53-108, их собирают, концентрируют и выдерживают при низкой тем25 пературе. Осадок отфильтровывают, получая 18,2 r непланоцина С в виде белого кристаллического вещества (чистота 96, выход 41,6 ).

Продукт растворяют в горячей во 11 де и выдерживают при комнатной температуре. В осадок выпадают бесцветные пластинчатые кристаллы непланоцина С. Фильтрованием получают чистый непланоцин С.

Пример 4, К фильтрату, при* готовленному в соответствии с методикой примера 1, добавляют 3,6 кг порошка активированного угля. После перемешивания в течение 40 мин акти 0 вированный уголь отфильтровывают и тщательно промывают водой. Элюирование осуществляют 70 -ным метанольным раствором. 40 л элюата су— шат в вакууме, получая 80 г сырого порошка, содержащего непланоцин О.

В колонку, заполненную 6 л силикагеля со смесью растворителей — н-пропанол: концентрированный водный раствор аммиака: вода-10:I 1, вводят

80 г сырого порошка и затем элюиоуют его той же смесьв растворителей. Фракционируют каждые 600 г элюата, Непланоцин 0 наиден во фракциях РР 20-37.

Указанные активные фракции собирают, концентрируют в вакууме до 30 мл 5 и выдерживают при охлаждении. Фильтрованием отделяют осадок, в результате получают 460 мг сырого кристаллического непланоцина О.

17 906388 18

460 г сырых кристаллов растворя- ного эфира (1: 1), дополнительно проют в 3 л горячей воды и вводят в ко- мывают серным эфиром и сушат, в релонку с Сефадексом G-15 (1850 мл, за- зультате получают 561 мг соединения полненную водой), затем элиируют во- (П ) (выход 74,3Е) . дой. Фракционируют каждые 100 мл элю- s Соединение (!1;) имеет следующие ата, собирают фракции элюата li II- 15-16 физико-химические характеристики. (200 мл) и концентрируют при пони- Гс 3 =-286,9 (с=0,6, СНСI ). Холе2З женном давлении до 20 мп, Получен- кулярная формула ЩИ О . Иоленый концентрат выдерживают при ком- кулярный вес 592. Точка плавления натной температуре. Получают 314 мл !0 235-239 р (разложение пены). УФ выделившегося в осадок непланоцина спектр (в метаноле) 2320 А, Е,!см

0 в виде белых кристаллов, =858, 5, 3230 А Е! с ц= 327, 5. В1 веПример 5. 376 мг непланоци- личина, Хлороформ: метанол=10:l, на D растворенного в 10 мл безвод- Rf =0,82. ного пиридина, тщательно перемешива- !> Б 31 мл безводного метилового ют при 55 С. По каплям к раствору спирта растворяют 525 мг соединения добавляют 0,9 мл хлористого бензо- (II) . Добавляют 0,62 мл свежеприила и перемешивают в течение 2 ч готовленного 2н. раствора метилата при 60-65 С. Раствор выдерживают при натрия в метаноле и кипятят при пе40-45 С в течение 2 ч и затем в те- >ll ремешивании 2 ч с обратным холодильчение 8 ч при комнатной температуре. ником, в результате чего удаляют

При перемешивании добавляют 10 мл бензоильные группы. воды и спустя 25 мин сушат при пони- После отгонки добавляют примерно женном давлении в испарителе. Высу- 50 мл метилового спирта и регулирушенный материал растворяют в 30 мл 25 ют рН до 7,5 добавлением уксусной хлороформа, промывают трижды )О мл кислоты. Раствор дважды экстрагируют

lн ° соляной кислотой и дважды lн. 20 мл этилового эфира уксусной кираствором бикарбоната натрия, после слоты и концентрируют водный слой, чего дважды промывают 20 мл воды. получая производное непланоцина

Хлороформовый слой обезвоживают без- ЗО D (!11) в виде игольчатых кристаллов. водным сульфатом магния и концентри- Осуществляют перекристаллизацию из руют до получения 747 мл соединения горячей воды, получая 110 мг произ(!) бледно-розовой окраски (выход 917). водного непланоцина D (1!!) (выход

Соединение (1) имеет следующие 44,37.), физико-химические характеристики 3S Производное нем ц ) ано ина 0 (Ill) ()

g>12 =-199 (С=О Ь метанол) . Иоле- имеет следующие физико-химические .3 р

3 1 кулярная ормула д т ф Г Н М 0, Молекуляр- свойства. Иолекулярная формула к ля ныи вес 280 (по ный вес 576 (масс-спектр). Точка С„Н„ и 0 S. Иолекулярный вес 280 по плавления 116-117 С. УФ спектр по- масс-спектру). Точка плавления 260я =2320 А. 1 . =704. 40 262 С (с разложением) . УФ спектро глоцения w,с г.= 1си

Е =388 6 3240 А, Rf величина. Хлороформ: метанол= в воде 2260 А, Е,„ =

Е =968 О. Величина Rf. Пропанол:

=10:1, Яд=0,53. ! си концентрированный водный аммиак:

Тщательно пеРемешивают 735 мг сое- вода !0.1.1 Rf=P 21 динения (I), и !,0736 г пентасульН р и м е р 6. К раствору

6. 37 мг фида фосфора, растворенного в 1с! мл

0 (!!! ) производного непланоцина пиридина. К смеси по каплям добавля5 в ют 0 18 мл воды. После кипячения с приготовленного по примеру, в ют 0,18 д

0,3 мл 0,4н. гидроокиси натрия дообратным холодильником в течение бавляют 0,009 мл метилйодида и встря4 ч при перемешивании реакционную хивают при комнатной температуре смесь охлаждают и концентрируют в в течение 10 мин. атем до а

О . 3 обавляют вакууме. В результате получают корич0,05 мл 0,4н. гидроокиси натрия и невый маслянистый продукт. ИасляО 009 мл йодидополнительно добавляют нистый продукт вливают в кипящую ают и выстого метила, вновь встряхивают воду при перемешивании и дополнитель- держивают при комнатной темпер атуре ° но перемешивают в течение 30 мин, 10 мл воК этому раствору добавляют получая желтоватый материал. его

2 мл ды, концентрируют в вакууме до мл фильтруют для отделения осадка, про1 4 К 49 см замывают смесью этилового спирта и сер- и вносят в колонку

906388

0 (3). полненную Сефадексом G-15. Элюирование осуществляют водой, и фракционируют каждые 3 г элюата. Собирают фракции №№ 17-19, концентрируют и охлаждают, получая 35 мг кристаллического производного непланоцина

0 (1Ч),(выход 90%) .

Производное непланоцина О(!Ч) имеет следующие физико-химические характеристики. с 3 =-141,7,(с=0,7, вода) . to

13

Молекулярная форр ула С QNр0 S.

42.

Молекулярный вес 294 (масс-спектр).

Точка плавления 177-178 С. УФ спектр в воде 2220 А, Е „=41,8, 2880 А.

Е4сц=-676, 3, 2950 ký,Ес ч=676 р 3 р 2950 Ар

Е =670,7. Величина Rf. Пропанол: концентрированный водный раствор аммиака: вода=10:1:1. Rf =0,42.

Пример 7. Синтез непланоцина А осуществляют из производного 20 непланоцина D (IЧ) . 50 мг производного непланоцина 0 (lЧ) р полученного в соответствии с методикой по примеру 6, растворенного в 1,5 мл метанольного раствора аммиака (О С насы- 25 щение),помещают в запаянную трубку и выдерживают при 146-148 С в течение 7 ч. После удаления растворителя при пониженном давлении остаток растворяют в 3 мл горячей воды, затем зо охлаждают, получая 33 мг непланоцина А в виде игольчатых кристаллов, (выход 74%).

Пример 8. К 1,14 г непланоци35 на 0 в 12 мл безводного пиридина добавляют 1 мл уксусного ангидрида и выдерживают при комнатной температуре в течение 8 ч. Добавляют 30 мл н-гексана и охлаждают в ледяной воде, получая 1 г кристаллического соединения (2).

1 г соединения (2 ) добавляют к

25 мл раствора, 0,8 мл тионилхлорида и 0,4 мл диметилформамида: в хлороформе и кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч при комнатной температуре. Хлороформ отгоняит при пониженном давлении, Остаток вливают в 100 мл ледяной воды при пере50 мешивании. Осуществляют экстракцию

100 мл хлороФорма, промывают бикарбонатом натрия и водой и сушат сульфатом натрия, После сушки в вакууме получают производное непланоцина D (3) .

$5

Пример 9. Синтез иепланоцина А иэ производного непланоцина

К производному непланоцина 0 (3), приготовленному в примере 8 и помещенному в стальную закрытую трубку, добавляют 35 мл насыщенного раствора аммиака в метиловом спирте и проводят реакцию при 100 С в течение 5 ч. После охлаждения реакционную массу сушат в вакууме и получают кристаллический порошок, который подвергают хроматографической очистке на силикагеле. Получают 286 мг непланоцина A.

Физико-химические характеристики идентичны тем, которые отвечают непланоцину А, приготовленному в примере 7.

Пример 10. Через колонку, заполненную 20 л катионо-обменной смолой Амберлит 1R-120 (Петипа) пропускают фильтрат (140 л, активностью примерно 50 мкг/мл как (непланоцин В) при-отовленный в соответствии с методикой примера 1, и затем промывают колонку примерно 100 л воды.

Элюирование адсорбированного материала осуществляют нормальным водным раствором аммиака, рН 3,7 ° Начальный элюат (30 л) сливают, а последующие 90 л элюата собирают, регулируют рН до 8 добавлением 6н. соляной кислоты, затем загружают в колонку с 4 л активированного угля, промывают водой, элюируют 90 л

70%-ного водного метанола. Таким путем полученньн . элюат концентрируют получая 500 мл концентрата, который выдерживают при низкой температуре для осаждения материала. Осадок собирают и сушат, получая 5,! л сы— рого непланоцина В (чистотой примерно 60%, выход 44%).

Пример li. Полученный в примере 10 непланоцин В (5,1 r) вводят в колонку с 2 л силикагеля (8,3 40 см), заполненную вместе со смесью ацетона и воды (10:0,5). Последующее элюирование осуществляют той же смесью растворителей, фракционируют каждые 80 r элюата, и фракции №№ 16-24 объединяют, Указанные активные фракции выдерживают при низкой температуре для осаждения непланоцина В в виде белых пластинчатых .кристаллов. Получают 2,57 г кристаллического непланоцина В (выход 32,8%).

Пример !2. Культивирование осуществляют в соответствии с

Фракции объединяют, концентрируют до 5 мл и выдерживают на холоде для осаждения непланоцина F в виде белых кристаллов. Осадок фильтруют и сушат, получая кристалличес,кий непланоцин F,(87 мг, выход 41%).

Пведложенный способ позволяет получить антибиотический комплекс. включающий непланоцины А, В, С, 0 и

Формула изобретения

Способ получения антибиотического комплекса, включающего непланоцины А, В, С, О и F общей формулы

ОН где Х вЂ” ЯЯ или ОН

ОН нон, Y

ВНИИПИ Заказ 419/78 Тираж 504 Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4

2! 906388 методикой примера I получая около

200 л культуральной массы. Эту массу фильтруют, и клетки промывают водой. Объединяют фильтрат и промывочные воды, получая 140 л (актив- 5 ность примерно 1,5 мкг/мл).

Раствор пропускают через колонку с 20 л катионо-обменной смолы

Амберлит IR-120 (Н+ типа) .для поглощения материала и затем промывают колонку водой (примерно 100 л) . Элюирование осуществляют 3,7н. водным раствором аммиака и сливают начальный элюат (30 л), 90 л последующего элюата собирают, регулируют его рН до 8, для чего добавляют 6н. соляную кислоту, затем вводят в колонку с 4 л активированного угля, промывают водой, элюируют 90 л 70%-ного водного метанола. Таким путем по- 20 лученный элюат концентрируют, получая 500 мл концентрата. Сушкой при температуре ниже 0 С получают 31,2 r сырого непланоцина F (чистотой около 0,5%). 2S

Пример 13. В колонку с

800 мл силикагеля и заполненную смесью — н-бутанол: 28%-ного водный аммиак: вода-10:0,2:1 вводят 31,2 r сырого порошка непланоцина Г, приготовленного в соответствии с методикой примера 12, и элюируют той же смесьв растворителей. Фракционируют каждые 150 мл элюата и объединяют фракции РР 5-10. Указанные фракции концентрируют в вакууме. Концентрат вводят в колонку с 240 мп силикагеля, предварительно заполнен-. ную смесью растворителей — хлороформ метанол: уксусная кислота=10:2:0,2, и элюируют той же смесьв растворителей. Получают фракции по 20 г.

Объединяют фракции РР 67-120, концентрируют их и сушат, в результате получают сырые кристаллы непланоцика F (108 r, выход 51%) .

Пример 14. Полученные в примере 13 сырые кристаллы непланоцина F,108 г) вводят в колонку с

186 мл Сефадекса 6"15, заполненную водой. Элюирование осуществляют водой. Отделяют фракции по,10 r и собирают фракции Р 22-27. Указанные гдЕ Г- — Π— иапо

5алвнтпнаЯ с3ЯЗд, отличающийся тем, что штамм Ашри11аriе11а А 11079 FERN-I

Р 4494 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганическое вещество, выделяют целевой продукт из культуральной жидкости и (или) разделяют его на непланоцины А, В, С, РиГ.

Приоритет по признакам:

25.05.78 — получение непланоцина А

10.08.78 — получение непланоци-i на С

29.0!.79 - получение непланоцина 0

23.02.79 — получение непланоци- . наВиР