Способ количественного определения антипирина в крови

 

Союз Советсиин

Социапистичесиин

Республик

О П И С А Н И Е (1)906941

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. саид-ву(53)M. Кл.

G 0-1 N 33/50 (22) За я влено 18. р у. 80 (21) 2959814/30-15 с присоединением заявки ¹

3Ъеуднрстненный комитет

СССР нв делам нэобретеннй н открытнй (23) Приоритет

Опубликовано 23.02.82. Бюллетень ¹ 7

Дата опубликования описания 23.02,82 (53) УДК 615.43:.

: 543. 43 (088.8) Е.Б. Смирнова, О. В.Каменцева, И.Ф.Долманова, С,В.Марцевич и В.И.Метелица (72) Авторы изобретения

Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР и Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного

Знамени государственный университет им. М ВъЯомоносова. (71) Заявители (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИПИРИНА

В КРОВИ

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использованоо в медицине, фармакологии и биохимии

Анти пири новый т ест пр едложен для количественного определения влияния различных факторов на способность печени метаболизировать лекарства.

Известен спектрофотометрический способ определения антипирина в крови. Антипирин экстрагируют из крови то хлороформом, затем его упаривают и остаток растворяют в разбавленной серной кислоте ° К раствору прибавляют нитрит натрия, измеряют величину оптической плотности образовавшегот3 ся 4-нитрозоантипирина при 350 нм. Концентрацию антипирина определяют по градуировочному графику (1)

Однако для известного метода on20 ределения необходимо от 1 до 5 мл крови на каждый из 6- 10 образцов, используемых при проведении фармококинетических исследовачий. При этом

2 анализ каждого образца занимает не менее часа. К недостаткам метода следует также отнести использование токсичного хлороформа.

Целью изобретения является сокращение объема исследуемого образца и времени определения.

Поставленная цель достигается тем, что образцы гемолизированной крови вводят в реакцию окисления ди фенилкарбазона перекисью водорода, после чего измеряют оптическую плот" ность пробы с интервалами во времени, а по изменению оптической плотности определяют антипирин в пробе.

ll р и м е р,А. Построение градуировочного графика.

У обследуемого до приема антипи" рина отбирают из пальца в микропробирку с 5 мкл гепарина примерно 0,15 мп крови ° Кровь подвергают гемолизу, помещая пробу на 30 мин в холодильник (5 С ). с последующим размораживанием. В четыре микропробирки

Т аблиц а

Значение оптической плотности в фиксированные моменты времени, с

Заданная конц ентр ац ия антипири на (для градуировочного графика), мкг/мл

Изменение опти чес кой плот нос и мин 10

Среднее зрачение

20 30

0,850 0,810

0,780 0,75

0,85О 0,800

0,820 0,765

0,870 0,810

0,870 0,810

0,860 0,790

21,65

О, 755

22,2

0,690

21,1

О, 740

26,1

26,2

26,15

0,710

0,735

31,9

0,735

31,9

31 90

0,700

38,4

3 90694 наливают по 30 мкл гемолиэированной крови. Пврвую пробирку используют как

"нулевую пробу", во вторую - четвертую пробирки прибавляют по 3 мкл водного раствора антипирина с концентрацией 100 мкг/мл, 300 мкг/мл и

500 мкг/мл антипирина соответственно. Таким образом, получают четыре образца, необходимые для построения градуировочного графика, с кон- ig центрациями антипирина во второйчетвертой пробирках соответственно

19 мкг/мл, 30 мкг/мл и 50 мкг/мл. Зти значения концентраций градуировочного графика находятся в пределах концент- is раций антипирина, наблюдаемых в крови обследуемых в течение 24 ч после приема 1 r антипирина.

Далее проводят реакцию окисления дифенилкарбаэона перекисью водорода в кварцевом смесителе с 3-мя отростками. В 1-ый отросток смесителя вводят 0,5 мл раствора дифенилкарбаэо» иа, во 2-й - 1 мл раствора перекиси водорода, в 3-ий - 10 мкл крови из

"нулевого" образца микропипеткой на

10 мкл. Промывают пипетку в тот же отросток смесителя 10 мкл боратного буферного раствора. Затем буфернь1м раствором доводят общий объем в смесителе до 10 мл.

Смеситель переворачивают, одновременно, включая секундомер. Энергично встряхивают. Через 5-10 с переливают раствор в кювету (длиной 3 см)

1 4 и на пятом светофильтре (480+10 нм)

ФЭК-56М измеряют значение оптической плотности через 20,30 и 45 с, после смешения. Каждый раэ после проведения измерений смеситель и кювету многократно пронь вают бидистиллированной водой .

Аналогично проводят реакцию с участием всех остальных образцов крови (концентрации антипирина 10, 30 и

50 мкг/л). Измерение каждой пробы осуществляют дважды.

На основании измеренных величин оптической плотности растворов, полученных через 20,30 и 45 с после смешения растворов, строят прямую в координатах оптическая плостностьвремя и определяют изменение оптической плотности л А за единицу времени gt или, что то же самое, тангенс угла наклона прямой (tg*).

В табл.1 приведены значения tg eL пвиведенные к 1 мин — =60 с), как обычно принято в кинетйческих методах анализа, а также средние значения йр с6, полученные по результатам двух измерений. Градуировочный график строят, откладывая по оси ординат средние значения tgd, а по оси абсцисс .- соответствующие известные концентрации антипирина в крови.

В табл.1 приведены данные для определения содержания антипирина в крови .

906941

Продолжение табл.1

"37,7

0,920 0,870

О, 760

38,05

Неизвестные концентрации анти пири на через 1 ч

0,950 0,875 0,800

36,0 после приема препарата

0,840

1,00 0,950

0,860 0,805

37,5

36,75 через.2 ч

0 740

29, 1. после приема препарата

O 860 . 0,800 О 740

29,1

29, 10

Введено перорально

100 мг

Метод определения антипирина

Время после приема антипики нети ческий найдено, мкг/мл Йайдено, мкгlмл рина, Обследуемый

46+ 3

25+ 2

46+ 2

22 1

Обследуемый

51+ 5

29+ 3

53+ 3

30+1

Аналогично указанному проводят и амер ения tg с(. дл я неи з вест ны х ко нцентраций антипирина (табл.1) и по градуировочному графику находят соот- Зо ветствующие значения концентраций анти пири на.

Полученные по градуировочному графику величины концентраций антипирина у двух обследуемых приведены в 35 табл.2.

Для проверки правильности метода все образцы крови исследовали на содержание антипирина одновременно спектрофотометри ческим методом. 40

В табл.3 приведены результаты определения антипирина кинетическим и спектрофотометрическим методами.

В. Определение концентрации антипирина в крови.

Обследуемый принимает 1 г антипирина. Через 1 и ? ч после приема препарата у него из пальца отбирают кровь в микропробирки по 30 мкл, в которые предварительно введено по

5 мкл гепарина. Пробы до анализа хранятся в холодильнике (-5oC).

Табли ца 2 спектрофотометри ческий

906941

Таблиц а 3

Метод определения антипирина

Мет од в вед ения анти пири на в кровь ки нети ческий спе ктр офот омет ри чес ки и найдено, мкг/мл введено, найдено, мкг/мл мкг/мл введено, мкг/мл

45+6

Как видно иэ табл.2 и 3, обоими методами получены близкие значения

I концентрации анти пири на.

По сравнению со спектрофотомет- 20 рическим методом кинетический метод анализа антипирина имеет ряд преимуществ.

В течение суток у обследуемого должно быть отобрано б- 10 образцов крови через определенные промежутки времени . При и с пол ьзова нии с пе ктрофотомет ри чес кого метода необ ходи мо

50 мл крови, что требует отбора крови из вены. Это связано с необходи- З0 мостью введения в вену катетера на весь период исследования, что весьма нежелательно. Для кинетического метода достаточно крови, взятой из пальца. Предлагаемый метод значител ь но сокращает вре мя анали з а. При

- использовании спектрофотометрического метода на анализ одного образца затрачивается 1 ч, а кинетического - t мин. 40

Кинетический метод прост и доступен. Для его осуществления требуется только смеситель и фотоэлектроФормула изобретения

Соста витель Л.Рубинова

Техред С.Мигунова Корректор Д.ференц

Редактор Л.Лукач

Заказ 501/28

Тираж 883 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, l!("35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Введено в венозную кровь (модельная система) 40 колориметр, тогда как для спектрофотометрического метода необходима дополнительно разнообразная специальная посуда для проведения предварительной экстракции.

Способ определения количества антипирина в крови, включающий подготовку образца крови, с последующим измерением его оптической плотности, отли чающий ся тем, что, с целью сокращения объема исследуемого образца и времени определения, обработку образца крови про водят путем гемолиэа с последующим введением его в реакцию окисления дифенилкарбазона перекисью водорода, после чего измеряют оптическую плотность пробы с интервалами во времени, а по,изменению оптической плотности определяют антипирин в пробе.

Источники информации, принятые во внимание при-экспертизе

T BioI Chem 179, Н 1, 25 (194",