Штамм еsснеriснiа coli в834 ( @ , @ ),несущий плазмиду rsf 2124,-тест субстрат для рестрикционной эндонуклеазы ecor11

 

ОП ИСАНИЕ

H3OSPEXaV ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Соцнаинстнчесннх

Реснубинн

< >908793 (6I ) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) Заявлено 17.09.79 (21) 2822401/30 — 15 с присоединением заявки М (23) Приоритет (51)М. Кл.

С 12 и 1/02

Ьауддретвввай квмктет

СССР

00 девам кзавретеккк и аткрнтк1

Опубликовано 28.02.82. Бюллетень J4 8

Дата опубликования опнсання 28.02.82 (M) УДК 66З.1, .11 (088.8) (72) Авторы изобретения

В. Г. Косых, Я. И. Бурьянов и А. А. Баев

Институт биохимии и физиологии мнкроортай змов АН- СССР

// (7I) Заявитель (54) ШТАММ ESCHERiCHiA С01! В834 (гв ° mI ) НЕСУЩ

ПЛАЗМИДУ RS F2124 — ТЕСТ вЂ” СУБСТРАТ ДЛЯ РЕСТРИКЦИОННОЙ

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЕСО R 11

Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой штамм EscherichIa col i, несущий плазмнду, используемую как тест.-субстрат для определения активности фермента прн выделении и очистке рестрикционной эндонуклеазы Есо

Я 11, которая используется в молекулярной биологии и генной инженерии.

Одним из последних достижений молекулярной биологии в последнее время является создание методов, которые позволяют получать рекомбинантные ДНК in vitro.

Рестрнкционные эндонуклеазы стали мощным инструментом при создании рекомбннантных

ДНК in vitro, а также для излучения первичной структуры и физического картироваиия

ДНК. Поэтому прогресс в молекулярной биологии н генной инженерии обусловлен прогрессом в области изучения и выделения ферментов рестрикционных эндонуклеаз, Среди рестрикционных эндонуклеаз, особое место занимает рестрикционная эндонуклеаза

Есо Я !1, которая узнает последовательность

5 %1"., ГГ 3 (! l . .

Однако рестрнктаза Есо R 11 —, это мелкощепящая эндонуклеаза, ДНК фага лямбда, она расщепляет бопеш чем на 35 фрагментов, в то время как другая широко используемая рестриктаза Есо R 1 — íà 6 фрагментов.

Таким образом, при вьщелении н очистке

Есо R 11 практически невозможно оценить активность электрбфорезом при использовании

ДНК фага лямбда. Множество фрагментов, 10 образующихся при гндролизе ДНК фага лямбда рестриктазой Есо Rll,,не дает ясной картины о степени гндролиза ДНК.

Для определения активности Есо Я 1! требуется ДНК-субстрат с небольшим молеку1S лярным весом, на роль такой ДНК могут подойти ДНК плаэмид.

Такими ДНК вЂ” субстратами могут быль

ДНК амплифицируемых, дающих множество копий ДНК на клетку, плазмид, например известная плазмида RS F2124, молекулярный вес 7,4 мегадальтон (2).

Однако эти плазмндные ДНК находятся в штаммах Е. co!i К, которые имеют специфический фермент llHK — цнтознн метилазу. Фермент

3 9I метилирует пито ил в llIIK и аким образом делает ЛНК плазмиц устойчивым к действию рестрикционной зндонуклсазы Eco R 11 (3}.

Поэтому пла.милы, находящиеся в этих штзммах, нс могут служить субстратом для

1.;со R 11. !1ля этих целей пригодны ЛНК, если они вьшелсны из штамма, не содержащего ЛНК- цитозинмстилазу.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки прямые палочковидной формы, 1,1 — 1,5x2,0 — 6,0 мк, подвижныс с псритрихиальными жгутиками, 18793 додецнлсульфата натрия, инкубирую во льду в течение 5-7 ч. Осветлснные лизаты получают центрифугированием смеси при 16000 д в течение 1 ч. К экстрактам добавляют СзС1 из расчета 0,94 г на 1 мл и бромид этидия до конечной концентрации 200 мкг/мл. Полученную смесь центрифугируют при 44000 об/мин в течение 40 ч в роторе Ti 50, Нижнюю, прокрашенную бромистым этидием зону, собирают по каплям, прокалывая пробирку под зоной. Бромид этилия удаляют 2-х кратной экстракцией изопропиловым спиртом. Полученную ЛНК диализуют против 10 мМ трис-НСI, рН 7,5, 20 мМ NBCI, 1 мМ ЭЛТА.

Пример 2. Трансформация плазмид оН ЛНК.

B 100 мл бульона вносят 1 мл культуры

Е. col i В834 и выращивают до плотности

0,4. После охлаждения клеток собирают центрифугированием и ресуспендируют в равном объеме 10 мл NaCI. После 20 мин инкубации во льду клетки собирают цснтрифугированием и ресуспендируют в I/2 объеме 75 мМ СаС1р.

Клетки инкубируют 20 мин и вновь собирают центрифугированием, Осадок рс< успсндируют в 1 мл 75 мМ Са Сl,. К 0 2 мл суспензии полученных клеток добавляют 0,1 мл ЛНК плазмиды RS F2124, инкубируют во льду

20 мин. Затем смесь подвергают " мин обработке при 42 C и выдерживают 15 мин при

24 С. Смесь разбавляют в 10 раз бульоном, подрашивают клетки 30 мин при 37 С и отбирают цо 0,1 мл суспензии, затем высевают на чашки с питательным агаром, содержащим

25 мкг/мл ампициллина.

Пример 3. Определение активности рестрикционной эндонуклеазы Есо R 11.

К 1 мкг ЛНК в буфере, содержа»цем

50 мМ трис -HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCI, 10 мМ

2-мсркаптоэтанола, 1 мМ ЭЛТА, добавляют

5 мкл эндонуклеазы Есо R 11, общий объем смеси составляет 40 мкл. Гидролиз ведут при

37 С в течение IS мин. Полученные фрагменты

jlHK анализируют с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном пластинчатом геле в трисацетатном буфере, рН 8,0.

Предалагемый штамм, несущий плазмиду, которая может быть использована в качестве тест-субстрата для рестрикционной эндонуклеазы Eco R 11, обеспечивает воэможность опре,деления и оценки зктивности фермента не только очищенного, но и в грубых экстрактах.

Формула изобретения

Штамм Escherichia co1i В834 (r>, пз„) несуший плазмиду RS F2124- ест-субстрат для рестрикционной зндонуклеазы Есо R II.

t рамотрицател»ные, неспороносные.

Культуральные признаки. Хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-псптонном агаре, питательном агаре

"Пифко", минимзльном агаре Дэвиса с глюкозой и каэзминовыми кислотами — колонии гладкие, круглыс, прижатые, блестящие, серые, щ край ровный, мутные (на синтетических средах — более слизистые и мутные). При росте в жидких р д х: мясо — псптонный бульон, бульон "Лифко", минимальный М9 с глюкозой и казаминовыми кислотами образуют ровную, интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки штамма.

Растет в пределах от 4 до 45 Г при оптимуме рН or 6,8 до 7,5. В качестве источника углерода использует многие углеводы, спирты, органическис кислоты, в частности d-глюкозу, d-фруктозу, сахзрозу, арабинозу, ксилозу, лактозу, трсгапозу. Не усваивает ацстат, аданит, галактозу, в средах с глюкозой активно подкисляст с образованием газа.

В качестве источника азота используют как

35 минимальные соли в аммонийной и нитратной формс, так в органической форме в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливает до нитритов.

Желантину не разжижает.

Урсазная активность не обнаруживается.

Индол не образует.

Проявляет устойчивость к антибиотикам— ампициллину (25 мкг/мл).

Пример 1. Выледение плазмидной

43

ДНК.

Клетки, содержащие плазмиду, выращивают в 500 мл бульона до плотности 0,6 (ФЭК. светофильтр М 6, кювета 0,5 см). Затем клетки собирают центрифугированием (6000

2!! мин), суспенпируют в 4 мл 25%-ной:: сахзрозы в 50 мм трис-НС I, рН 3,0, добавлякт 1,2 мл лизоцима (10 мг/мл) и

)пюубируют 10 мин во льду при перемешивании.

К смеси д< бавляют 2,4 мл 0.25 М ЭЛТА 55 (р Н 8.0), оставляют во льду íà 10 мин, а эмем доп яляюг последовательно 2,6 мл SM раствора !ЧзС! и 1,2 мл !О ."-ного рзсгвора Ю8793

Составитель М. Мирзаев .

Техред Э.Фсчо

Корректор Г. Огар

Рслакгор Е. Дичинская

Подписное

Заказ 749/27 Тираж 505

В1(ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент",.r. Ужтород, ул, Проектная, 4

Хранится an Всесоюзной коллегии микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР цод номером

ВКМ — 1442Д, Источники информации, принятые во внимание прн экспертизе

1, 8199ег С. Н. et а1 t etnre New Bioto1зу. 1979, v. 244, р, 7-10.

2. 8в М. et. а1. Мо1. Gen. Оепет1са. 1976, v. !42, р. 239.

% 3. Гусейнов О. А. и др. Биохимия. т. 43.

1978, 1718 (прототип). ю