Способ определения @ -глутаминовой кислоты

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союэ Советских

Соцналнстнческнх

Республик о»910763

4 . (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 140490 (21) 2914254/23-04 (ЩМ Кп з с присоединением заявки ¹

С 12 Ц 1/00

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (23) Приоритет ($3I УДК543.9 (088. 8) Опубликовано 070382 Бюллетень № 9

Дата опубликования описания 0703.8. (72) Авторы мзобретеим я

P.Ï. Янушевичуте, Б.И. Ческис, A. — A.Á. Пау и Д.A. Казлаускас

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИ Я b-ГЛУТАИИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к количественному определению Ь-глутаминовой кислоты, и может использоваться для контроля технологии и качества L-глутаминовой кислоты, для анализа пищевого и кормового сырья и продуктов.

Известны способы энзиматическипотенциометрического определения Ьглутаминовой кислоты, основанные на измерении выделяющейся двуокиси углерода СО селективным электродом (1).

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения Ь-глутаминовой кислоты путем обработки анализируемой пробы энзимом на основе L-глутаматдекарбоксилазы.

Выделяющаяся при этом углекислота вызывает изменение потенциала СО селективного электрода. Концентрацию

L-глутаминовой кислоты определяют по калибровочному графику зависимости потенциала ст концентрации кислоты (2).

Недостатками укаэанного способа являются большой расход водорастворимого препарата, L-глутаматдекарбоксилазы и недостаточно выраженная количественная зависимость между концентрацией L-глутаминовой кислоты и потенциалом электрода.

Цель изобретения — упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения

L-глутаминовой кислоты путем обработки анализируемой пробы энзимом на основе

L-глутаматкарбоксилазы, иммобилизованной на силохроме,содержащем бромацетильные группы, с последующим потенциометрическнм измерением образующейся двуокиси углерода, з качестве энзима используют L-глутаматдекарбок.силазу, иммобилизованную на силохроМе, содержащем бромацетильные группы, I1 р и м е р 1. Получение иммобилизованной Ь-глутаматдекарбоксилазы.

В качестве носителя используют аминопропилсилохром СХ-2,5 с размером гранул 0,1-0,2 мм. Для введения бромацетильных групп 5 г носителя суспендируют в 40 мл диоксана, прибавляют

0,56 г бромуксусной кислоты и зквнвалентное количество 0,83 r N, N --дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают на качалке при комнатной температуре в течение 3 ч. По" лученный активированный носитель промывают диоксаном, водой и 0,1 М фос910763 фатным 4уферньм раствором (рН 7,2} .

Для иммобилизации используют препарат

L-глутаматдекарбоксилаэы из Езсйег1с-

hia coll шт. В00, с активностью

46 Е/мг белка (Е-мкмоль лмин ) . В

40,0 мл раствора Ь-глутаматдекарбоксилазы (0,1 N фосфатный буфер, рН

7,2, концентрация белка 6,26 мг/мл) суспендируют 5 г активированногс носителя, и смесь перемешивают н.::<ачалке 18 ч при 4 С. Затем носитель 10 со связанным ферментом промывают водой 1 М раствором NaCE и 0,05 М фосфатным буфером (рН 6,0) . Активность иммобилизованного препарата

1508 E/ã, выход по активности 65,5В.

Иммобилизованный препарат хранят в холодильнике (4 С) в виде суспензии в 0,05 M фосфатном буфере (pH 6,0), содержащем 0,026 мг/мл пиридоксальфосфата. 20

Пример 2. Методика определения L-глутаминовой кислоты. в котором смонтированы стеклянный и вспомогательный электроды. При этом шарик стеклянного электрода, предварительно покрытый тонким слоем элект-. ролита, остается отделенным от реакционной смеси воздушным зазором.

L- глу тами н овую кислоту декарбоксилиРуют ферментом, иммобилизованным на гранулах силохрома,, содержащего бром ацетильные группы. Выделяющаяся двуокись углерода растворяется в электролите, вследствие чего происходит изменения его рН, пропорциональное концентрации Ь-глутаминовой кислоты.

Изменения рН регистрируют с помощью самопишущего потенциометра и цифрового вольтметра. L-Глутаминовую кислоту определяют по калибровочному графику, показывающему зависимость изменений рН электролита от концентрации L-глутаминовой кислоты. После анализа испытуемый раствор отфильтровывают, промывают Зх2 мл 0,05 М буферным раствором рН 3,8, содержащим 5.10 М пиридоксальфосфат и 0,05 М NaCE, и анализируют другой образец, используя тот же ферментный препарат.

Концентрацию (С)L-глутаминовой кислоты определяют по калибровочному графику или рассчитывают по формуле, полученной преобразованием уравнения калибровочной прямой. Коэффициенты уравнения калибровочной прямой получены обработкой методом наименьших квадратов данных зависимости 6 рН от о С растворов L-глутаминовой кислоты с известной концентрацией (коэффициент корреляции 0,9997) .

Уравнение калибровочной прямой рН вЂ” 3,239-0,914 0og С.

Концентрация Ь-глутаминовой кисло— 3,2Ъ9-*pH тм (моль/л) С:<Π—

0 944

Перед измерением в реакционную ячейку вносят 170 мг иммобилизованной

L-глутаматдекарбоксилаэы (260 Е) .

Исследуемый раствор. L-глутаминовой кислоты подготавливают установлением рН 3,8-4,0 0,1 N-раствором HCk или

НаОН и внесением NaCE в таком количестве, чтобы конечная концентрация

NaCE была 0,05 N. Блок электродов рН-метра помещают на вспомогательную ячейку, содержащую раствор электролита (0,005 М ИаНСОз, 0,005 М NaCkg 1% метилцеллюлозы и 0,1Ъ твин-20), так, 35 чтобы шарик стеклянного электрода был полностью погружен в раствор. После уравновешивания электрода, избыток электролита с поверхности шарика удаляют при помощи полиуретановой 40 губки. Блок электродов переносят на реакционную ячейку. Измерение выделяющейся двуокиси углерода осуществляют обычным стеклянным Н+чувствительным электродом, который отделен от реакционной смеси воздушньм зазором. Исследуемый раствор помещают в ячейку и закрывают буоком, Коэффициент вариации метода

v-2Ä3%. Производительность 10«12 образцов/час.

В таблице приведены сравнительные технические данные по известному и предлагаемому способу.

6,0 (О, 2-10)

1,7 (0,4-10)

Анализируется только

L-глутаминовая кислота точ нос ть, Ъ (мг% ) Избирательность

Отклик 1-3 (Весь анализ 5-6) Отклик 1 5- 20 м

0,05

0,22

-Объем пробы, мл

1,5

Длительность определения, мин

Предел обнаружения

?-глутаминовой кислоты, мг

Анализируется только

Ь-глутаминовая кислота

910763

Составитель A.Æèäèêoâà

Редактор Л.Авраменко i.Техред З.Фанта Корректор У.Пономаренко

Заказ 1030/2 . . Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР но делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Пате т", r.yæãoðîä, ул.Проектная,4

Иэ приведенных данных следует, что предлагаемый метод значительно превосходит известный по быстроте анализа, а уступает только по предегу обнаружения. Поскольку имеется практическая потребность в экспресс-анализе Ь-глутаминовой кислоты в микробиологичес5 кой и химико-фармацевтической промьаа.-. ленности, где приходятся иметь дело с концентрациями порядка 0,1-3%, меньший предел обнаружения не является.. недостатком. Предлагаемый способ позволяет сразу анализировать более концентрированные растворы (до 1,5В) беэ их разбавления, в то время, как по известному способу нельзя определять Ь-глутаминовую кислоту в раство- (Ю рах с концентрацией более 0,01%.

При определении концентрации L-глутаминовой кислоты по известному способу расход фермента составляет в 20 среднем 20 Е на анализ. В предлагаемом способе исходное количество иммобилизованного фермента (260 Е) может быть испальзовано для проведения минимум 1000 анализов.

Кроме того, способ может быть ocy"" ществлен при исчользовании обычного рН-электрода.

Формула изобретения

Способ определения L-глутаминовой кислоты путем обработки анализируемой пробы значимом на основе L-глутаматдекарбоксилаэы с последующим потенциометрическим измерением выделямцейся двуокиси углерода, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве энзима используют Ь-глутаматдекарбоксилазу, иммобилизованную на силохроме содержащем брсмацетильные группы. ,Источники информации,. принятые во внимание при экспертизе

1. Yao S. У. et al. Ро еп 1схае1

ric йейегю1па е of 2 lutamic and

pyruvic acids wea enz1mate(dicarbaxy

lation,. "В1ое1ес госЬеа Bioenerg", 1976, 3, р. 106-112.

2. Ahn В.K. et al А enzime elec-.

trode for the determination of Zgeutamke acid. "Bioelectrochem.

Bloenerg,", 1975, 2, р.142-153 (про« тотип) .