Способ культивирования энтомопатогенных бактерий

 

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ включающий высев бактерий на среду, содержащую кормовые дрожжи, кукурузную муку, гидрол, гидролизат хлопкового шрота и а&рацию в дробном режиме, отличающийся тем, что, с целью увеличения спор, культивирование осуществляют на среде, содержащей, вес.%: Дрожжи кормовые 2,0-4,0 Мука кукурузная 1,2-2,4 . Гидрол.0,5-1,5 Гидролизат хлопкового шрота 3,0-14,0, Вода. Остальное а аэрацию до полного спорообразоваV ) С . ния поддерживают на уровне 0,33 1 ,40 об/об мин и затем снижают до 0,15-0,5 об/об мин. ч ч со

CQI08 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (д) А 01 И 63/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ CCCP

ПО ДЕЛАМ ИЗОВ ЕТЕНИЙ И ОтНРЫТИЙ

" (21) 2921395/30-15 (22) 13. 05. 80 (46) 15 ° 10. 84. Бюл. 1) 38 (72) В.И. Огарков, К.П. Гапонов, А.С.. Белых, P.Х. Сагиров, Ю.Л. Игнатов, В.Ю. Ракитин, В.Н. Давыдов, Т.А. Нугманова, Н.В. Чекотина и Н.В. Прокофьева (71) Всесоюзный научно- исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии (53). 63.576.8(088.8) (56) 1. М.N". Файбич. и др. Влияние различных источников углерода, содер,жащих полисахариды, на рост и раз-

-множение Bacillus thuringiensis в ,средах для пройзводства энтомопатогенных микробиологических препаратов

))., "Микробиология", 1973, Р 9;

2. Авторское свидетельство СССР по заявке 9 2777387/30-15, кл. С 12 К 1/06, 1979 (прототип). (54) (57) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ," включающий высев бактерий на среду, содер-. жащую кормовые дрожжи, кукурузную муку, гидрол, гидролизат хлопкового шрота и аэрацию в дробном режиме; отличающийся тем, что, с целью увеличения титра спор, культивирование осуществляют на среде, содержащей, вес.7.:

Дрожжи кормовые 2,0-4,0

Мука кукурузная 1,2-2,4

Гидрол„ 0,5-1,5

Гидролизат хлопкового шрота 3, 0-14, О, Вода Остальное а .аэрацию до полного спорообразова,ния поддерживают на уровне 0,33—

1,40 об/об мин и затем снижают до .0,15-0,5 об/об мин.

911765

Изобретение относится к области технической микробиологии и может .быть использовано для получения энтомопатогенных препаратов, являющихся средствами защиты растений, 5

Известен способ культивирования бактерий вида Вас. thuringiensis в лабораторных условиях на дрожжеполисахаридной среде, содержащей З кормовых дрожжей (БВК) и 1,5 кукуруз-. 10 ной муки при постоянном режиме аэрации Е1 3. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предложенному является способ культивирования энтомопатоген- 15 ных бактерий на среде следующего состава, Х: кормовые дрожжи 3,0-4,5„ кукурузная мука 1,2-2,5; гидрол 2,04,0 и гидролизат хлопкового шрота

3;4-6,8 с содержанием аминного азота 2р

300-400 мг% (2 3. Недостатком указанных способов является относительно низкий выход споровой биомассы энтомопатогенных бактерий.

Целью изобретения является увели- 25 чение титра спор микроорганизмов.

Это достигается за счет сокращения в составе среды количества гидрола и гидролизата хлопкового шрота при соответственном изменении режима аэрации, заключающемся в снижении уровня аэрации в процессе культивиро.вания.

В соответствии с предлагаемым способом энтомопатогенные бактерии выращивают на среде следующего сос тава, вес. :

Дрожжи кормовые. 2,0" 4,0

Мука кукурузная 1,2-2,4

Гидрол ° 0,5-,1,5 4о

Гидролизат хлопкового шрота 3,0-14

Вода Остальное

При этом уровень аэрации с нача45 ла процесса до момента полного споро-"5 образования составляет 0 33 1,4 об/об мин, а с момента йолного спорообраэования до момента освобождения спор у 10Х бактерий 0,15—

0,5 об/об мин, после чего аэрацию прекращают.

Существо способа заключается в следующем, Предварительно готовят питательную среду. Для этого дрожжи и муку 55 смешивают с водопроводной водой в количестве 60Х от необходимой для приготовления соответственного объе ма среды. Суспензию перемешивают, нао гревают до 80 С и выдерживают при этой температуре 20 мин, далее добавляют ферментативный гидролизат хлопкового шрота, оставшуюся воду и охлажцают до. 40-45 C. Доводят рН до

7,6+О, 1 20Х-ным раствором NaOH. Cpeо ду стерилизуют при температуре 133 С в течение 30 мин. Отдельно готовят стерильный гидрол. Срерилизацию гидрола проводят при 120 С в течение

25 мин. Стерильный гидрол добавляют в среду непосредственно перед посевом культуры.

Ферментативный гидролизат готовят следующим образом. Водопроводную воду нагревают до температуры 53+2 С, загружают 2Х от взятой воды хлопкового шрота, добавлением раствора едкого натра устанавливают рН суспензии

8,0+0,2. После чего добавляют фер- мент протосубтилин ГЗХ (с активностью не менее 100 ед. по модифицированному методу Ансона) в, количестве 0,8-. 1 от навески шрота. Процесс гидролиза проводят в течение 4 ч при постоянном перемешиванни, поддержании температуры и .рН в указанных выше пределах. По окончании гицролиза суспензию нагревают до 80 С, выдерживают о при этой температуре 20 мин, после. чего мешалку отключают, после отстаивания гидролизата в течение 20 мин проводят его декантацию и с помощью вакуума:переводят в другой реактор.

Готовый гидролиэат содержит около

40 мг аминного азота.

Подготовленную описанным выше способом питательную среду засевают штаммом энтомопатогенных бактерий.

Культивирование осуществляют в течение 32"35 ч при дробном режиме аэрации. C начала процесса и до момента полного спорообразования обеспечивают максимальный режим аэрации, составляющий 0,33-1,4 об/об мин в эависимости от объема ферментера. Моментом полного спорообразования счита- . ется такое состояние культуры, при котором не менее чем у 95 клеток сформировались зрелые споры, опре деляемые методом прямого микроскопирования. Затем интенсивность аэрации сокращается до уровня О, 150,5 об/об мин и поддерживается на таком уровне до момента, при.котором не менее чем у 10 клеток освобождаются споры. После этого аэриро9117

Корректор О. Тигор

Техред M.Íàéü

Редактор П.Горькова

Заказ 7492/2 Тираж 721 Подписное

BHHHGH Государственного комитета СССР ао делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 Раушская наб., д. 4/S

Филиал ППП "Патент", г..ужгород, ул..Проектная, 4

3 ванне среды полностью прекращается и полученная культуральная жидкость направляется на переработку.

П р н м е р 1. Готовят 7 л среды следующего состава,.вес.Х:

Дрожжи кормовые 4,0

Мука кукурузная 2,0

Гидрол 1,0

Гидролизат хлопкового шрота 10,0 10

Вода Остальное

Культивирование проводят в лабораторном ферментере объемом 10 л. Посев среды осуществляют суспензией спор бактерий Bacillus thuringiensis var.

galleriae шт. 69/6 в количестве

30 мл с концентрацией спор 10 спор/мл.

Непосредственно после посева обеспечивают интенсивность аэрации—

1 об/об мин, поддерживая ее на этом gp уровне до 22 ч роста. В этот момент

95Х клеток содержит сформировавшиеся споры. После чего интенсивность аэрации снижают до 0,3 об/об мин и культивирование продолжают еще 10 ч.

После 32 ч аэрации у 12Х клеток споры выходят из культуральной жидкости и в этот момент аэрация полностью прекращается . Культуральную жидкость .выдерживают еще в течение 5 ч на холоде до полного освобождения спор от клеточньк оболочек. Титр спор составляет

9,00 10 э спор/мл.

Пример 2. Культуру Вас.thuringiensis v, dendrolimus grr.87-продуцент дендробациллина выращивают в

35 ферментере объемом 630 л на среде этого же состава, что и в примере 1.

В течение 23 ч аэрацню поддерживают на уровне 1,4 об/об мин. На двадцать

40 третий час 99Х клеток содержит сфор;мировавшиеся споры и в этот момент

65 4 интенсивность аэрации снижена до

0,5 об/об мин. В таком режиме. культивирование продолжается до момента выхода спор у 15Х клеток, что имеет место на двадцать девятый час культивирования. После этого аэрацию полностью прекращают, в рубашку ферментера подают холодную воду и выдерживают культуральную жидкость в течение 5 ч до 98Х. выхода спор из клеток .

Титр спор составляет 10,08 109спор/мл.

Пример 3. Культуру Вас. thuringiensis v. dendrolimus шт. 49/8продуцент дендробациллина выращивают в ферментере емкостью 63 м на среде того же состава, что в примере 1. В течение 22 ч интенсивность аэрации составляет 0,33 об/об мин. На пвалиать втооой час 95Х клеток сопевжит

"формировавшиеся споры и в этот мо- . мент интенсивность аэоапии т меньшена до О, 17 об/об мин. В этом режиме культивирование продолжается до момента выхода спор у 10Х клеток, что имеет место. на тридцать второй час культивирования. После этого аэрацию полностью прекращают, культуральную о жидкость охлаждают до 20 С и выдерживают еще 3 ч. Титр спор составляет

9,4 10 спор/мл.

Таким образом, предложенный способ культивирования бактерий вида

Вас. thuriengiensis может быть.использован для получения энтомопатогенных препаратов на основе различньк вариантов этого микроорганизма как в лабораторных, так и в промышленных условиях.

Предложенный способ обеспечивает повышение выхода спор по сравнению с промьппленно-освоенным способом более чем в 3 раза.