Питательная среда для получения @ -маннаназы
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Соввтсиик
Социвпистнчвскик
Республик
С 12 Х 1/20 61вудвРСтв @ КВИКтет СССР ав делан изобретений и етерыткй Опубликовано 15.07.82. Бюллетень № 26 Дата опубликования описания 15 07.82 (53) УЙК 577.15 (088.8) С . - Г.А. фирантас, 3. -8. В. Башкис, А; -А. Б. Паулюконис и Ю.Ф.Василяускас (72) Авторы изобретения (7I) Заявитель Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ P -ИАННАНАЗЫ 3,4-3,6 0,09-0 11 О, 019-0, 021 0,29-0,31 0,019-0,021 0,06-0,07 Изобретение относится к микробиологической промцшленности и может быть использовано при получении ферментного препарата ф -маннаназы. Известна питательная среда для получения р-маннаназы íà Bacillus sub5 tilis G-78, содержащая картофельный крахмал, кукурузный экстракт, пивные дрожжи и минеральные компоненты:аммоний фосфорнокислый двухзамещенный, магний сернокислый, марганец сернокислый, калий сернокислый, хлористый кальций и воду !13. Недостатком данной среды является низкая продуктивность в отношении фермента J5-маннаназы, активность которого 3,5-4,0 Е/мл при продолжительности культивирования 20-24 ч. Цель изобретения — увеличение активности выхода целевого продукта и 2î снижение его себестоимости. Поставленная цель достигается тем, что среда, содержащая картофельный .крахмал, жидкий кукурузный экстракт, 2 двухзамещенный фосфорнокислый натрий; сернокислый аммоний, сернокислый марганец пятиводный, сернокислый магний, сернокислый калий, хлористый кальций, гидроокись натрия и воду, дополнительно содержит муку из семян люцерны или муку из корней эремуруса в. качестве индуктора при следующем соотношении компонентов, мас. Ф: Картофельный крахмал 5,5-5,7 Жидкий кукурузный экстракт Двухзамещенный фосфорнокислый натрий 0,45-0,50 Сернокислый аммоний 0,24-0,28 Сернокислый марганец пятиводный Сернокислый магний Сернокислый калий Хлористый кальций Гидроокись натрия 9432 Оь9. 1ю1 Т аб ли ц а 1 Р-манна1 Питатель- Индуктор Концентраная среда ция индук тора, 4 Биомасса, условные единицы Опыт назная. активность, Е/мл, х +Sx 1 Исходная (известная) 3,8 0,3 62+4,2 20,1+1,6 59i3,8 Галакто- 0,25 маннан 3 Исходная Глюкоман- 0,1 (извест- нан ная) 16 5т1,3 60+3,7 57+4, 1 0,25 512332 Предлагаемая Галактоманнан Глюкоман547i29 60 3,8 0,1 нан 1,0 531128 65>5,0 Мука из семян люцерны Мука из корней эремуруса о,5 528i27 63а4,4 П р и м е ч а н и е. Опыты 1, 6 и 7 проводят в пятикратной повторности, опыты 2, 3, 4 и 5 проводят в трехкратной повторности. Х - среднее арифметическое, S„ среднеквадратическая ошибка. Люцерновая мука или мука из корней эремуруса 0,4-0,6 Вода Остальное Питательную среду для получения агманнаназы предлагаемого состава получают путем последовательной оптимизации исходнои питательной среды с применением математических методов планирования эксперимента. На послед- tp Такой эффект объясняется тем,что Р-маннаназа штамма Baccillus subtilis G-78 является индуцируемым ферментом, а состав полученной среды обуславливает индуцирующий эффект галактоманнана и глюкоманнана. 77 4 нем этапе оптимизации питательной среды, равно как и в начале работы, изучается индукция образования маннаназы бактериями Bacillus subtilis IG-78 путем включения в питательную среду субстрата (галактоманнана или глюкоманнана). Результаты опытов представлены в табл. 1. " р и м е р 1 Приготавливают питательную среду для получения 55 -маннаназы из Bacillus subtilis G-78 в ферментерах объемом 1,5 м с коэффициентом наполнения 0 5 ° Питательная среда Показатели Известная Предлагаемая Время культивирования, ч 15 .-маннаназная активность культуральной жидкости, Е/мл 4,0 550 «Общий выход ферментного препарата р-маннаназы в1м Е 2,2 106 2,76..108 Формула изобретения 5 9432 В ферментер заливают 300 л подогретой до 60 С водопроводной воды, при перемешивании последовательно ,загружают 42 кг осахаренного карто фельного крахмала, 7,5 кг муки из семян люцерны, 1,95 кг (1 1Н4) S04, 2,25кг KgS04, 0 75 кг MnSO458p и 0,15 кг MgS04 . Стерилизуют 30 мин при 130 С. После стерилизации охлаждают до 45оС. Отдельно в приготовленный чан залива- 10 ют 120 л подогретой до 60 С воды и при перемешивании добавляют 26 кг жидкого кукурузного экстракта и 0,15 кг СаС1, перекачивают в сателлит и сте1 рилизуют в сателлите 45 мин при 15 135оС. После стерилизации охлаждают до 45оС и стерильным воздухом передавливают в ферментер. Отдельно в приготовительный чан заливают 120 л подогретой до 60оС водопроводной воды 2в и в ней растворяют 3,6 кг Иа НР04 и 0,5 кг ИаОН, перекачивают в сателлит и стерилизуют 30 мин при 130 С.После стерилизации охлаждают до 45ОС и стерильным воздухом передавливают в фер- 25 ментер. Стерильную питательную среду охлаждают до 40оС и засевают культурой Bacillus subtilis G-78, рН при посеве 6,8-7,2. В течение первых двух часов температура падает до 37ОС и .поддерживается постоянной во время всей ферментации. Расход воздуха 55 м /ч до конца ферментации. Продолжительность ферментации 15 ч. Об окончании ферментации судят по максималь35 ному накоплению Фермента ф-маннаназы в культуральной жидкости. Для определения fb-маннаназной активности биомассу и остатки среды отделяют центрифугированием. В надосадочной жидкости оп- 40 ределяют р -маннаназную активность, которая составляет 550 Е/мл. f5-маннаназную активность определяют по методу ВЛ .Melleary, Carbohydrate Research, 67, 213-221, 1978.3а 4s условную единицу активности принимают такое количество фермента, которое ,дает увеличение оптической плотности 1 .при длине волны 590 нм на 0,1 после инкубации реакционной смеси, состоящей из 1,5 мл 0,4i-ного субстрата и 0,5 мл ферментного раствора, при 40оС, рН 5, 8 за 30 мин. Пример 2. Приготовление питательной среды и получение фермента ф-маннаназы производят как в примере 1, только вместо люцерновой муки в состав питательной среды включают 0,6Ф муки из корней эремуруса. р-йан77 6 наназная активность культуральной жидкости 550 E/ìë. Данные сравнительной характеристики ф-маннаназной активности культуры Bacillus subtilis G-78 на известной и предлагаемой питательной среде, приведены в табл. 2. Т а б л и ц а 2 Как видно из табл. 2 на предлагаемой среде штамм Bacillus subtilig G-78 дает увеличение выхода фермента более, чем в 100 раз. Себестоимость целевого продукта в соответствии с увеличением выхода Фермента снижается на такую же величину, т.е. около 100 раз. По предварительным подсчетам годовая экономическая эффективность при использоваНии предлагаемой среды, в производстве препаратов 1ъ -маннаназы в количестве, необходимом для удовлетворения потребностей винодельческой промышленности СССР (10 усл. т.) 68,5 тыс. руб. Питательная среда для получения р-маннаназы из Bacillus subtllis G-78, содержащая картофельный крахмал,жидкий кукурузный экстракт, двухзамещенный фосфорнокислый натрий, сернокислый аммоний, сернокислый марганец пятиводный, сернокислый магний, сернокислый калий, хлористый кальций, гидроокись натрия и воду, о т л и ч а ю3,4-3,6 Составитель И.Привалова Редактор Н.Киштулинец Техред Ж. Кастелевич Заказ 5037/34 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Корректор И.МУска Подписное Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 7 9432 щ а я с я тем, что," с целью увеличе" ния активности и выхода целевого продукта и снижения его себестоимости, она дополнительно содержит муку из семян люцерны или муку из корней эрему- руса в качестве индуктора при следующем соотношении компонентов, мас. Картофельный крахмал 5,5-5,7 Иидкий кукурузный 10 экстракт Двухзамещенный фос" форнокислый натрий 0,45-0,5 Сернокислый аммоний 0,24-0,28 77 8 Сернокислый марганец пятиводный 0,09-0,11 Сернокислый магний 0,019-0,02li Сернокислый калий 0,29-0,3h Хлористый кальций 0,019-0,021 Гидроокись натрия 0,06-0,07 Мука из семян лю- 0,9-1,1 церны или мука из корней эремуруса 0,4-0,6 Вода Остальное Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР и 740830, кл. С 12 0 13/10, 1978.
