Штамм bacterium prodigiosum (serratia marcescens) в-10, м-2 - продуцент неспицифической эндонуклеазы

 

сотОч советских

СОЦЮЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУВ.ИИК

ОПИСАНИЕ -ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ HATERTllOE

ВЩОМСПЮ СССР (ГОСШТЕНТ ССЩ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 2788997/15 (22) 0407.78 (46) ЮЛ133 Ваа Йе 43-42 (73) Институт антологии и генетики CO AH СССР (72) Панфилова З.И„ Салганк P.È (19) S (11) 928794 Al (5f) C12N1 2 С12Х9 N

2(54) ШТАММ BACTERlUM РЙОМОВ$ОМ (SERRATlA МАЙСЕВСЕЙЗ) В-.10, М-2- ПРО-:

ДУЦЕНТ НЕСЙИЦИФИЧЕСКОЙ ЗНДОНУКЛЕАЗЫ (57) 928794

Изобретение относится к микробиологии и представляет собой новый штамм

Bacterium prodigiosum(S.marcescens) B-10, М-2, который может быть использован как продуцент неспецифической эндонуклеазы— препарата для борьбы с вирусными инфекционными заболеваниями животных и насекомых.

Известен штамм Bacterium prodiglosurn (S,marcescens} B-10. М-1, синтезирующий внеклеточную неспецифическую эндонуклеазу в количестве до 3600 ед/мл культуральной жидкости при выращивании на пептонной среде.

Однако штамм Bacterium prodlglosum (S marcescens) 8-10, M-1 обладает недостаточно высокой активностью внеклеточной неспецифической эндонуклеазы для получения фермента.

Цель изобретения — увеличение активности — достигается тем, что штамм Bacterium

prodigiosum 8-10, М-2 получают из исходного музейного штамма В.prodigiosum 8-10, М1 под действием нитрозометилмочевины.

Для этого культуру Bacterium prodigiosum

8-10, М-1 выращивали в минимальной среде следующего состава: лимонная кислота-моногидрат 22 г; ИаО 0,04 г; Mn$0< -4HzO 0,04 г; глюкоза 10,0; рН доводили до 7,0 МН4ОН. вода дистиллированная 1 л до оптической плотности (ОП) 0,63 (ОП измеряли с помощью фотоэлектроколориметра ФЗК-М. светофильтр М 3). Культуру охлаждали в течение 1 ч, центрифугировали (5000 об/мин) . 20 мин, разводили в свежей среде до ОП 0,2, добавляли в среду нитрозометилмочевину до 0,2 ф> и бактерии инкубировали в течение

15 мин при встряхивании на качалке при

ЗО С. Обработанную мутагеном суспензию высевали на чашки Петри с индикаторной средой для выявления продуцентов эндонуклеазы. Индикаторная среда содержала

PHK (рибонуклеиновая кислота) 0,6 мг/мм и толуидиновый голубой (0,017), который окрашивает среду с, РНК в голубой цвет. Вокруг колоний бактерий, выделяющих эндонуклеазу, через 24 ч роста в результате гидролиэа РНК появлялись ореолы ярко-розового цвета, Отбирались колонии с.большими -no сравнению с контролем зонами рибонуклеазной активности. Отобранные варианты проверялись на эндонуклеазную активность при выращивании на пептонной среде, При такой проверке был отобран мутант

В,prodigiosurn 8-10, М-2, характеризующийся следующими свойствами, Морфология. Клетки - подвижные короткие палочки, одиночные, парные или в цепочках; грамотрицательные. Величина клеток односуточной культуры на рыбном питательном агаре (РПА) l-3 х 0,6-0,8 мкм.

Культуральные признаки и фиэиологобиохимические свойства, При посеве на

РПА колонии округлые, гладкие, диаметром

1,5 мм(через 48 ч роста при+30 С). Профиль колоний выпуклый, Пигментная окраска колоний, характерная для вида B.prodlgiosum, отсутствует, Желатину разжижает, молоко свертывает, крахмал гидролизует слабо, клетчатку не разлагает, нитраты ВоссТаНааливаетдо нитритов. Штамм является ауксотрофом, Иэ глюкозы, сахарозы, мальтоэы, маннита образует кислоту, на лактозе кис«5. лоту не образует. Оптимальный режим роста: температура 28-30 С; рН среды 7-8.

При лабораторной проверке эндонук- леазиой активности полученного штамма

B.prodiglosurn 8-10, M-2 и сравнении ее с

20 активностью . известного штамма

В,prodiglosurn 8-10, М-1 при выращивании на пептонной среде оказалось, что

B.prodlglosum 8-10, М-2 к 24 ч роста образует по 15000 ед. фермента на 1 мл среды, 25 иногда как известный штамм B.prodiglosum

8-10, М-1 образует к 26 ч роста 3600 ед. эндонуклеазы.

Активность фосфодиэстеразы у штамма

B.prodlglosum 8-10, М-2 составляет 0,130 0,«4 i„а активность фосфомоноэстеразы

0,004-0,016 g, от активности неспецифической эндонуклеаэы в период 24-31 ч роста.

У известного штамма В.prodlglosum 8-10, М-1 активность фосфодиэстераэы составля35 ет 1,0ф и активность фосфомонозстеразы . 0,13-0,36ф от активности основного фермента.

Выращивание штамма В.prodiglosum

8-10. М-2 для проверки эндонуклеазной ак40 тивности проводили при условиях, описанных для известного штамма В.ргой9!озогл

8-10, M— - 1.

Сравнительные данные по динамике накопления зндонуклеаэы предлагаемого

45 штамма B.prodlgiosum 8-10, M-2 и известного штамма B.prodlglosum В— - 10, М-1 представлены в таблице, П ример, Штамм B.prodlglosum 8-10, М-2 выращивали на скошенном рыбном пи50 тательнам агаре в течение 24 ч. Клетки суспендировали в физиологическом растворе до плотности 1х1 кл/мл и инокулировали в количестве 1х10 кл/мл в 25 мл пептонной среды следующего состава: пептон i6 г;

55 NaCl 5,0 г; MgClz 0,1 г; трис-буфер 6,05 г;

Н О дист. 1,0л,,рН 8,2-8,3. Инкубирование проводили а колбах 3рленемейера объемом

100 мл со встряхиванием на качалках (160 об/мин) при 30 С. Через определенные интервалы времени из культуральной среды

928794

Составитель

Тех ред М.Моргентал

Корректор Офравцова

Редактор О.Колоскова

Заказ 3239

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035,.Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 отбирали пробы по 5 мл, проводили испытание на внеклеточную эндонуклеаэную активность. Проверку превращения РНК или

ДНК в олигонуклеотиды под действием культуральной жидкости проводили по появлению кислоторастворимого материала с адсорбцией при 260 нм.

При измерении активности фосфомоноэстеразы эа единицу активности фосфомонозстеразы принимали увеличение оптической плотности на 0,1 ОП при 400 нм

Формула изобретения

ШТАММ ВАСТЕИОМ PRODIGIOSUM (SERRATIA MARCESCENS) В-10, М-. 2,—

jirpopyn неспецифической эндонуклеазы за 15 мин инкубации при 37 С. В качестве субстрата использовали и-нитрофенилфосфат натрия.

За единицу актив юсти фосфодиэстера5 эы принимали увеличение ОП раствора Сабис-нитрофенилфосфата на 0,1 ОП при 400 нм за 15 мин инкубации при 37 С. Измерение проводили на спектрофотометре СФ-16 в кюветах 1 = 1 см . э

10 (56) Авторское. свидетельство СССР

N. 431214, кл. С 12 К 1/02, 1974. е, хранится в музее культур промйшленных микроорганизмов "ВНИИгенетика" М

ЦМПМ В-1992.