Способ получения l-треонина

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскиз

Социааистичеакиз

Pecny6nw п1>943282 (6f) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 13.07.79 (21) 2781356/28-13 с присоединением заявки ¹

t51)hA Ка э

С 12 P 13/08

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (23) Приоритет

1Щ УДК 668. 394 (088.8) (Опубликовано 1Ь0782. Бюллетень ¹26

Дата опубликования описания 15.07.82

В.Г.Дебабов, Н.И.Жданова., А.К.С

Ю.И.Козлов, Е.М.Хургес, Н.К.Янк

A.Ô.ØoëèH, В.П.Антипсв и (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательс и селекции промышленных микроорганизмов ки. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения Ь-треонина. 1реонин является незаменимой аминокислотой, которая ширско применя5 ется как компонент различных питательных смесей медицинского назначения.

Кроме того, L-треонин .может быть использован в качестве добавки в пищу человека и в корм животных, а так же как реактив для фармацевтической и химической промышленности.

В настоящее время Ь-треонин получают путем прямой ферментации беэ предшествекников с использованием штаммов продуцентов таких видов как Brevibacterium fRavum, Escherichia coRi, Corinebacterium acetoaciЙорЬИит, Proteus rettgeri,, Serrafia marceSceus, Aегоbacter aегоgenes, Corynebacterium gRutamicum на питательных средах, содержащих в качестве источников углерода глюкозу, фруктозу, ацетат, этанол или добавления витаминов и аминокислот или их содержащих субстратов, а также содержащих источники азота и необходимые минеральные соли.

Известен способ получения L-трео- нина с использованием мутантных

l штаммов Escherichia coRi при глубинном культивировании на питательных средах, ссдержащих углеводы, источники азота, минеральные соли при добавлении в среду чистых аминокислот и витаминов или содержащих их гидролизатов белковой массы. При этом достигнут максимальный выход 10,4 г/л

Ь-треонина в ферментационной среде за 96 ч ферментации (11.

Однако применяемые мутантные штаммы Escherichia coRi характеризуются потребностью в изолейцине или в изолейцине и метионине.

Известен также способ получения

L-треонина путем культивирсвания продуцирующих его микроорганизмов вида Escherichia сое1 на питательной среде, содержащей источники углерода,.азота и необходимые минеральные соли в присутствии антибиотика с последукхсим выделением целевого продукта Г2 .

Общим недостатком описанных способов является невысокий уровень накопления Ь-треонина на углеводах, в частности на глюкозе, которая является предпочтительным сырьем при . прсизводстве Ь-треонина для медицинских целей, кроме того, слишком

943282 большое время ферментаций (96-120 ч), на этом сырье.

Цель изобретения - повышение выхода продукта и сокращение времени ферментации.

Поставленная цель достигается тем, 5 что согласно способу в качестве микроорганизмов, .продуцирующих Ьтреонин, из вида Escherichia coti используют штамм Escherichia coRi

ВНИИгенетика М-l, а в качестве ан- 1О тибиотика - пенициллин.

При этом пенициллин вносят в ис.ходную питательную среду в количестве 0,1-0,5 г/л, Кроме того, культивирование ведут на питательной среде, содержащей питательную добавку в виде гидролиэата белковой массы, например кислотного гидролиэата, ферментолизата или автолизата дрожжей. 20

Причем в процессе культивирования целесообразно вводить сбалансированную подпитку, содержащую глюкозу и раствор аммиака.

Штамм ВНИИгенетика М-1 отобран 25 в рассеве штамма VL 334 р УН 7. От исхсдного штамма он отличается заметным мукоидным характером поверхности колоний, повышенной способностью к продукции треонина, более высокой стабильностью при росте на средах с питательными.добавками, т.е. способностью пОпуляции клеток сохранить основные свойства (продукцня треонина и устойчивость к пенициллину) после культивирования в этих условиях. Штамм девонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов при институте

ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ЦМПМВ-1856. 40

Штамм ВНИИ-генетика М-1 сохраняет полезные генетические свойства исходного штамма ВНИИгенетика

71 334 р YN 7 (способность к сверхсинтезу треонина и устойчивость 45 к пенициллину, что определяется содержанием в клетках амплифицированной гибридной плаэмиды pYN 7), но отличается от него рядом морфологических признаков, более высокой ста- 5р бильностью сохранения своей популяции клеток в ходе ферментации на средах с питательными добавками и способностью к более высокому уровню накопления L-треонина. 55

Введение в исходную питательную среду пенициллина 0 1-0,5 г/л позволяет использовать обогащенную питательными веществами среду беэ потери оснавных свойств штамма и тем са- 60 .мым резко повысить скорость наращивания биомассы в начальной стадии ферментации, за которой следует .процесс интенсивного биосинтеза

L-треонина.

Предлагаемый способ предусматривает ведение процесса ферментации в оптимальных условиях, за счет поддержания в ходе процесса оптимального соотношения углерода и азота и постоянного уровня рН, что достигаетоя путем введения в ходе ферментации сбалансированной. подпитки, содержащей глюкозу и раствор .аммиайа.

Предлагаемый способ позволяет получить в фермеитерах емкостью

0,5 л до 30 г/л Ь-треонина эа 40 ч ферментации на питательной среде, содержащей глюкозу, минеральные соли и питательные добавки в виде гидролизата, ферментолиэата или автолиэата биомассы дрожжей при добавлении в исходную -питательную среду пенициллина 0,1-0,5 г/л.

Характеристика штамма Escherichia !

coRi ВНИИгенетика М-l.

Штамм Escherichia coflВНИИгенетика М-l, продуцирующий L-треонин хранится í L,åíòðàëúíoì музее проьаишленных микроорганизмов института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер

B-1856.

Морфологические признаки. Грамотрицательные слабо подвижные тонкие палочки с эакругленньэ|и концами, размером 1,5-2 мм в длину..

Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар. Через

24 ч роста при 37 С образует круглые, беловатые, полупрозрачные на свет колонии, диаметром 2-3 мм, поверхность колонки . гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агаризованная минимальная среда (Адамса) с глюкозой. Через 2-е сут роста при 37вС образует колонии диаметром 1-1,5 мм, серовато-белые, круглые с равными краями, слегка выпуклые, внутренняя структура однородная, поверхность блестящая, через 4-5 сут колонии приобретают слизистую (мукоидную)консистенцию.

Рост в мясо-пептонном бульоне.

После 24 ч раста при 37ОС наблюдается сильное помутнение, небольшой осадок, запах характерный.

Рост в жидкой минимальной среде

Адамса. Через двое сут роста при

37 С с азрацией наблюдается сильное о равномерное помутнение, запах отсутствует, Рост по уколу в мясо-пептонном

arape — хороший по всему уколу.

Желатину - не разжижает.

На.молоке.- хороший рост с коагуляцией молока.

Индол — образует.

Рост на различных углеводах. Хорошо растет на глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе, 943282 глицероле и маннитоле с образованием кислоты и газа.

Устойчивость к антибиотикам. Устойчив к пенициллину.

Штамм не патогенен.

Содержание плазмиды. В логарифмической стадии роста клетки содер.жат около 17 копий плаэмиды РУН 7 (мол.вес 5,7 мегадальтон), обеспечивающей устойчивость штамма к пенициллину и несущей гены треонинового оперона.

Потребность в факторах роста.

Растет на минимальной глюкоэо-солевой среде (время генерации 240 мин).

Рост стимулируется изолейцином (время генерац: и 60 мин).

Способ осуществляется следующим образом.

Посевной материал культуры микроорганизма Escherichia cori ВНИИгенетика М-1 выращивают в течение

48 ч на агаризонанной минимальной среде, содержащей пенициллин (500 мкг/мл), и затем смывом физиологическим раствором клеток с поверхности косяка готовят клеточную суспензию, которую используют для засева ферментационной среды.

Начальная концентрация клеток н рабочем ферментере может составлять около 2-5-10 кл/мл. Исходная питательная среда содержит глюкозу, минеральный азот., соли, .пенициллин и питательные добавки в виде гидролизатон белковой массы, например кислотных гидролизатов автолиэатон или ферментализатон дрожжей. Начальный РН среды устанавливают на уровне 7,0-7,2 и затем автоматически поддерживают в этих пределах в ходе ферментации с помощью датчика РН путем введения сбалансированной подпитки, содержащей аммиак (водный раствор) и глюкозу. В виду того, что снижение РН среды в ходе культивирования продуцента треонина обусловлено уменьшением концентрации аммония (азота) в среде вследствие. утилизации его продуцентом, а соотношение между схоростями утилизаци азота и глюкозы остается примерно постоянным, то соотношение между количеством данных компонентов в питательной смеси должно соответствовать соотношению между скоростями утилизации этих компонентов культуре продуцентом, что и достигается путем выделения н ходе ферментации вышеуказанной подпитки. Температуру поддерживают .на уровне 35-37ОC. Через

40-43 ч ферментации образованный в питательной среде L-треонин выделяют следующим методом. Биомассу клеток продуцента отделяют либо сепарированием, либо фильтрованием после преднарительной обработки окисью кальция (известковым молоком) и ортофосфорной кислотой. С учетом содержания треонина и катионов в нативном растворе, а также пигментных

5 соединений нативный раствор пропускают через ряд последовательно соединенных колонн с осветляющим сорбентом для поглощения окрашенных соединений и сульфокатионитом, на1О пример, КУ-2-8, Диайон .SK-IB или другим аналогичного типа в Н-форме, -для сорбции катионов и треонина.

Сорбированный треонин эллюируют с колонны с сульфокатионитом раствоРом аммиака. Фракции элюата, сойеРжащие основное количество треонина, упаринают под вакуумом, охлаждают и кристаллизуют: треонин. Для ускорения кристаллизации может быть использовано добавление спирта. Полученный трионин хроматографнчески однороден и содержит 97-99% основного вещества. Для получения препаратов для медицинских целей достаточно пронести дополнительную перекристаллизацию. Такие препараты могут быть использованы в средах для культивирования клеток тканей. Выход по предлагаемому методу 80-95%.

При высокой концентрации треонина н культуральной жидкости (вьют 18 г/л) относительно низком содержанйи примесЕй треонин может быть выделен без использования стадии сорбции на ионитах. Для этого.оснетленный растЗ5 вор концентрируют уравниванием в вакууме при невысоких температурах и кристаллиэуют треонин прн пониженной температуре с добавкой или беэ добавки этилового спирта. После

40 перекристаллиэации получают L- реонин с содержанием основного вещества 99%.

Пример 1 ° Посевной материал культуры продуцента Escherichia

4 со01 ВНИИгенетика М-1 выращивают в течение 48 ч на агаризованной минимальной глюкозосолевой среде, следующего состава, г/л: глюкоза 5;0;

NH4C8 1,0; КН2Р04 1,5; Na HPOq 3,5;

50 )4gS04 7Н110 0,1; пенициллин 500 мкг/мл, агар-агар 20,0; вода дистиллированная, РН 7,0-7, 2. Глюкоза и пинициллин стерилиэуются отдельно и добавляются в расплавленную среду перед ее охлаждением и посевом. Выросшую культуру смывают стерильной водопроводной водой,: и полученную клеточ.ную суспензию используют для засева ферментерон.

Ферментацию проводят на лабораторном ферментере емкостью 0 5 л.

Состав исходной питательной сре ды, об.%г (N}i4)gSOy 1,8% HÐO4 О, 2%

65 Мд$04 0,04%

943282

Кислотный гидролизат

БВК (в расчете на сухой вес) . 0,34

Пеногаситель 0,1%

Питательную среду стерилиэуют совмеотно с аппаратом, после чего вводят 5 в среду стерильную глюкозу 2% и пенициллин 0,5 г/л. Ферментацию ведут при температуре 35-37ОС с.введением сбалансированной иодпитки, содержащей аммиак в колкчестве 2,5«2,73 и глюкозу в концентрации 353. Подпитку вводят по сигналу датчика рН.

Уровень рН устанавливают в пределах 7,0-7,2, сульфитное число Фермента 3,5-4,0 r 01/л.ч. Через 40 ч 15 ферментации в культуральной жидкости накапливается Ь-треонин в количестве 30 г/л. Затраты глюкозы на синтез треонина б r/r.

Далее L-треонин выделяют из куль- 20 туральной жидкости. Для этого к

300 мл культуральной жидкости с концентрацией треонина 30 г/л прибавляют при перемешивании 3 г окиси кальция и затем добавляют ортофосфор 25 ную кислоту до достижения величины рН 5,6, раствор нагревают до 60еС выдерживают 10 мин и отделяют биомассу на Фильтре под вакуумом. Полученный нативный раствор (оптическая плотность 0,4 при 525 нм в 1 см кювете) пропускают через колонку с

50 мл осветляющей смолы ИА-lр и осветленный раствор (оптическая плотность 0,08) пропускают через колонку со 150 мл сульфокатионита КУ-2-8 в Н+ — Форме, колонку промывают

300 мл воды. Сорбированный треонин элюируют раствором ЗЪ-ного аммиа-ка, элюат упаривают под вакуумом до содержания сухих веществ 25а, до- 4о бавляют этиловый спирт в соотношении 1:1 и оставляют кристаллизоваться в течение 10 ч при температуре

Оо +5 C. Кристаллы L-треонина отфильтровывают, промывают и сушат. 45

Получают 8,1 r L-треонина (выход

9ОВ). Анализ методом ТСХ (10 мкг) показывает отсутствие других аминокислот

Пример 2. Посевной материал культуры продуцента Escherichia

coRi ВНИИгенетика М-1 приготавливают по примеру 1. Ферментацию ведут на ферментере емкостью 0,5 л. .Состав исходной питательной среды по примеру 1 за исключением того, что в качестве питательной добавки используют ферментолизат БВК в количестве 0,6 Ъ вместо кислотного гидролиэата BBK. Условия ферментации . 60 как в примере l. Через 41 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается Ь-треонин в количестве 29 г/л. Далее L-треонин выделяют, из культуральной жидкости. для этого 65

300 мл нативного раствора треонина после отделения клеток продуцента центрифугированием культуральной жидкости (сухих веществ в нативном растворе 7,5% оптическая плотность

0,6 (525 мм) упаривают под вакуумом при 50 С до объема 50 мл, добавляют такой же объем этилового спирта и кристаллизуют треонин в течение 5 ч при О С.. Полученные кристаллы отделяют фильтрованием, промывают 15 мл этилового спирта и сушат. Получают 6,1 r Ь-треонина, не содержащего по анализу методом

ТСХ (10 мкг) примесей других аминокислот.

Пример 3. Посевной материал культуры продуцента Escherichia

coRi ВНИИгенетика М-1 приготавливают по примеру 1. Ферментацию ведут на ферментере емкостью 2 мЭ.

Состав исходной питательной среды по гримеру 1, за исключением того, что в качестве питательной добавки в питательной среде испсльзуют автолнзат дрожжей в количестве 0,4%, а содержание пенициллина 0,2 г/л.

Через 43 .ч ферментации в культураль-ной жидкости накапливается 18 г/л треонина, Расход глюкозы » по примеру 1 °

Таким образом, предлагаемый способ превосходит по эффективности все известные способы получения

L-треонина на углеводной среде.

За 40-43 ч Ферментации с использованием нового штамма Escherichia

coRi ВНИИгенетика М-1 на обогащенной питательной среде с добавлением пенициллина в исходную питательную среду, способ позволяет получить в культуральной жидкости до

30 г/л L-треонина без примесей других аминокислот.

Фсрмула изобретения

1. Способ получения Ь-треонина путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида Escherichia coRi на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые минеральные соли в присутствии антибиотика, с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода L-треонина и сокращения времени ферментации, в качестве микроорганизмов, продуцирующих Lтрернин, из вида Escherichia coRi исполвзуют штамм, Escherichia coRi

ВНИИгенетика И-l, а в качестве антибиотика - пенициллин.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юi4 и и с я тем, что пенициллин вно943282

Составитель М.Ларина

Редактор М.Бандура Техгед Ж. Кастелевич КорректорИ-ИУска Заказ 5037/34 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР. о делам изобретений и открытий

113035, Иссква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,.4 сят в исходную питательную среду в количестве 0,1-0,5 г/л.

3. Способ по п.1, о т л и ч аю шийся тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержа« щей питательную добавку в виде гид» 5 ролизата белковой массы, например кислотного гидролизата, Фермеитолизата или автолизата дрожжей.

4. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в процессе «уль- 10 тивирования вводят сбалансированную подпитку, содержащую глюкозу и раст» вор аыкиака.

Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Англии В 1223470, кл. С 2 С, опублик, 1971.

2. Заявка ФРГ В 1792495, .кл,. С 12 9 13/06, онублик. 1972.