Олигомер урокиназы,обладающий фибринолитическим действием,и способ его получения

 

1. Олигомер урокиназы общей формулы . (Y; -foc-(cH2)3-ot т Y - остаток урокиназы; где h 2-3; hr 1-2; MM 65-10 -96-103, обладающий фибринолитическим действием . 2. Способ получения олигомера урокиназы общей формулы (Y)(CH2)3-Oi«, где V - остаток урокинаэы; п 2-3; И1 1-2; ММ 65-103-9610, обладающего фибринолитическим действием , заключающийся в том, что урокиназу растворяют в О,10-0,15 М фосфатном буферном растворе, затем в § раствор последовательно вводят глутаровый диальдегид при массовом соотношении урокиназы глутарового диальдегида 5:0,55-1,, 1 и 4,0-5,4%-ный водный раствор тригидроксиметиламинометана , а целевой продукт вьщеляют гель-хроматографией. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУЬЛИК

„„Я0„„948114 (5Ц4 С 08 Н 1/02 ъ л ъ чт,л з

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (у)Д-Ос — (сн );op, ГОСУДАРСТ8ЕККЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2964752/23-05. (22) 29.07.80 (46) 15.03.86. Бюл. 11 10 (72) Т.Ф. Сухарева, С.В. Кольцова, В.Ф. Даниличев и Г.В. Самсонов (53) 547.458(088.8) (56) Ambrus С.М. and etc. I. Med, 1972, 3, 270. (54) ОЛИГОМЕР УРОКИНАЗЫ, ОБЛАДАЮЩИЙ

ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ

ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (57) 1. Олигомер урокиназы общей формулы . <у +ос — (сн,),— op„ где — остаток урокиназы; и 2-3; ь = 1-2 з

ММ 65 ° 1 0з 96 ° 1 0з обладающий фибринолитическим действием.

2. Способ получения олигомера урокиназы общей формулы где 1 — остаток урокиназы;

1 = 2-3;

1т = 1-2;

ММ 65 10 -96 10з обладающего фибринолитическим действием, заключающийся в том, что урокиназу растворяют в О, 10-0, 15 M фосфатном буферном растворе, затем в раствор последовательно вводят глутаровый диальдегид при массовом соотношении урокиназы глутарового диальдегида 5:О, 55-1, 1 и 4,0-5, 4Х-ный водный раствор тригидроксиметиламинометана, а целевой продукт выделяют гель-хроматографией.

Изобретение относится к олигомерным формам протеазыурокиназы общей формулы

948114

Поставленная цель достигается олигомером урокиназы общей формулы где (, — остаток урокиназы; н = 2-3

У

1-2, ММ 65.10з-96 10з способам получения олигомерных форм, сохраняющих ферментативную активность, и может найти широкое при-менение в лабораторной практике для модельных экспериментов.

Известен продукт, полученный способом ковалентной иммобилизации урокиназы на карбокснметилцеллюлоза гидразиде.

Способ получения этого продукта включает следующие технологические операции: ,0,5 r карбоксиметилцеллюлозагидразида суспендируют в 75 мл

0,5 М раствора NaCE и перемешивают 15 мин; к суспензии добавляют 5 мл 5Х-ного раствора NaNO2 и перемешивают

20 мин; выпавший азид отделяют центрифугированием, осадок промывают 1 М раствором NaCt и бикарбонатным буферным раствором; осадок суспендируют в растворе урокиназы в бикарбонатном буфере; рН суспензии доводят до 8,5 и перемешивание ведут 12 ч при 4 С, затем промывают водой и бикарбонатным буферным раствором; все операции проводят при охлаждении с преднарительно охлажденными реагентами, продукт реакции— суспензия иммобилизованной протеаэы — хранится при охлаждении.

Полученная иммобилизованная урокиназа стабильна при 4 С в течение

6 месяцев, за это время она сохраняет 55Х исходной активности.

Основным недостатком известного способа является получение продукта с низкой (1Х) специфической активностью и нерастворимостью.

Целью изобретения является получение водорастворимых форм ррокиназы, повышение специфической фибринолитической активности. где Y - остаток урокиназы;

H = 2-3;

Ич = 1-2, МИ 65 ° 10 »96 10 .

Указанный олигомер является новым, в литературе не. описан.

Способ получения олигомера урокиназы общей формулы

f5 где lf — остаток урокинаэы;

1 = 2-.3;

1-2, ММ 65 10 "96 10, обладающего фибринолитическим действием, заключается в том, что урокинаэу растворяют в О, 10-0,15 М фосфатном буфере, за25 тем в раствор последовательно вводят глутаровый диальдегид при соотноше-, . нии урокиназы и диальдегида 5:0,551> 1 и 4,0-4,5Х-ный водный раствор тригидроксиметиламинометана, а целевой продукт выделяют гель-хроматографией.

Способ осуществляют следующим образом. Урокиназу с активностью

1000 ед Плоуга/мг растворяют в

О, 10-0, 15 М фосфатном буферном раст35 воре с рН 6,0-6,2 и добавляют 2,02,2Х-ный водный раствор глутарового, диальдегида.

Смесь перемешивают при 20-22 С

10-360 мин при соотношении уроки40 назы и глутарового диальдегида

5: 1,0-1,1.

В реакционную смесь добавляют

4,0-4,5 -ный водный раствор тригидроксиметиламинометана.

4S Полученный раствор с рН 6,0-6,2 гель-хроматографируют на сефадексе

С-100, уравновешенном 0,10-0,15 М фосфатньм буферным раствором с р 6,0-6,2. Элюцию ведут тем же бу50 ферным раствором.

Биологическая активность олигомерной модификации урокиназы изучена при лечении экспериментальной гифемы животных.

55 Пример 1. 10 мг урокиназы с активностью 1000 ед Плоуга/мг белка растворяют в 3 мл 0,10 М фосфатного буферного раствора с рН 6 0.

948114

Медленно добавляют О, 10 мл 2,2Х-ного гкутарового диальдегида при соотношении.урокиназы и глутарового диальдегида 5: 1, 1. Смесь перемешивают 30 мин, при 22 С к ней добавляют 5

0,10 мл 4,5Х-ного триокснметиламинометана. Через 10 мин полученную смесь вводят в хроматографическую колонку,(1,5х150 см), заполненную

300 мл сефадекса С-100, уравновешен- 10 ного О, 10 М фосфатным буферным раствором с рН 6,0. Гель-хроматографию проводят при 5 С со скоростью о

15 мл/ч. Элюцию проводили 0,10 М фосфатным буферным раствором с 15 рН 6,0.

Количество выделенной растворимой олигомерной урокиназы 6,0 мг, что составляет 60Х от количества фермента, взятого в реакцию. 20

Пример 2. 10 мг урокиназы с активностью 1000 ед Плоуга/мг белка растворяют в 3 мл О, 15 М фосфатного буферного раствора с рН

6,2. К полученному раствору добавля- 25 ют О, 10 мл 2,0Х-ного раствора глутарового диальдегида при соотношении урокиназы и глутарового диальдегида 5:1. Смесь перемешивают

120 мин при 20 С, добавляют 0,10мл 30

4,0Х-ного раствора триоксиметиламинометана. Реакционную смесь гель1 хроматографируют в условиях примера 1. Элюцию ведут со скоростью

20 мп/ч. Общее количество растворимой олигомерной урокиназы 7,6 мг, что составляет 76Х от количества фермента, взятого в реакцию.

Пример 3. 10 мг урокиназы с активностью 1090 ед Плоуга/мг бел- 40 ка растворяют в 3 мл 0,10 М фосфатного буферного раствора с рН 6,0.

К раствору добавляют 0,10 мл 2,0Х-ного глутарового альдегида (соотношение урокиназы и глутарового альдеги- 45 да 5: 1). Смесь перемешивают 360 мин .при 20 С, добавляют 0,10 мл 4,5Х-ного раствора триоксиметиламинометана.

После перемешивания в течение 10 мин

О при 22 С реакционную смесь гель-хро- 50 матографируют в условиях примера 1 при 5 С со скоростью элюции 15 мл/ч

Общее количество растворимой олигомерной урокиназы составляет 9,5 мг или 95Х от количества фермента, взя- 55 того в реакцию.

Пример 4. 50 мг урокиназы с активностью 200 ед Плоуга/мг белка растворяют в 16 мл 0,05 М фосфатного буферного раствора с рН 6,0.

К раствору добавляют 0,5 мл ?,2X-ного раствора глутарового альдегида.

Смесь перемешивают 60 мин при

20 С, добавляют 0,5 мл 4,4Х-ного раствора триоксиметипаминометана.

После первмешивания в течение 10мин о при 20 реакционную смесь вводят в колонку (Зх80 см) с сефадексом С-100 для отделения олигомерных форм урокинаэы от немодифицированного фермента. Элюцию ведут при 5 С О, 1 М фосфатным буферным раствором со скоростью 20 мл/ч. Общее количество растворимой олигомерной урокиназы составляет 35 мг или 70Х от количества фермента, взятого в реакцию. Активность олигомерной урокиназы составляет 20Х от исходной активности урокиназы.

Характеристики олигомерных форм урокиназы приведены в табл. 1.

Таблица 1

Активность, X. к исходной. урокиназе

При- Выход мер димера тример, высшие (MM 65000), (MM 96000) олигомеры

Х (ММ 200000;

1 32/40

2 34/45

3 38/50

21/20 6/5

28/20 . 14/1 О

36/15 21/5

Пример 5. 15 мг урокиназы с активностью 1000 ед. Плоуга/мг белка растворяют в 5 мл О, 1 M фосфатного буферного раствора с рН 6,0.

К полученному раствору добавляют

0,075 мл 2,2Х-ного глутарового диальдегида (соотношение урокиназы глутарового. диальдегида 5:0,55).

Смесь перемешивают 2.ч при 20 С.

Затем добавляют 0,075 мл 4,5Х-ного триоксиметиламинометана. После перемешивания в течение 10 мин при 20 С реакционную смесц гель-хроматографируют в условиях примера 1 при

5 С со скоростью элюции 15 мл/ч. .Общее количество растворимой олигомерной урокиназы составляет

9,9 мг или ббХ от количества фермента, взятого в реакцию: из них дн948114

Продук

Димер (ММ 65 10 ) 29

Тример (ММ 96 "10 ) 31

Высшие олигомеры (ММ 200 10 з) Редактор О. Куз нецова Техред С. Мигунова Корректор И. Эрдейи

Заказ 1166/2 Тираж 471 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 мер 29Х, трнмер 31Х, высшие олигомеры 6Х.

Характеристики олигомерных форм урокиназы приведены в табл. 2.

Т а б л и ц а 2

Активность исходной и олигомерных форм урокиназы определяют по усовершенствованному методу Аструпа на фибриновых пленках.

Расчет активности проводят по калибровочной зависимости, полученной для стандартной урокиназы с

5 активностью 500 ед. Полуга на ампулу.

В качестве активных олигомерных форм используют смесь димеров и трнмеров, отделяя высшие олигомеры, характеризующиеся пониженной биологической активностью.

При лечении экспериментальной гифемы терапевтический эффект при одно- или двукратном введении олигомерной активной формы урокиназы аналогичен терапевтическому эффекту при шестикратном введении мономер-. ной урокиназы в эквивалентных дозировках на одну инъекцию.

Это.свидетельствует о существовании пролонгирования действия модифицированной олигомерной активной формы урокиназы.